对人类拓扑异构酶的蛋白质组学分析揭示了它们独特而多样的细胞功能

《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteomic analysis of human topoisomerases reveals their distinct and diverse cellular functions

　　本研究利用TAP-MS技术系统解析了人类五种拓扑异构酶（TOP1、TOP2A/B、TOP3A/B）的蛋白互作网络，发现TOP1与PUM3存在特异性互作并伴随核定位变化，TOP3A与NSMCE4A、YTHDC2、NDUFAF7形成新互作网络，TOP3B与TDRKH（TDRD2）在细胞质中共定位。研究揭示了拓扑异构酶在RNA代谢、DNA损伤修复及转录调控中的交叉功能，为开发新型抗癌策略提供潜在靶点。

　　DNA拓扑异构酶是一类在细胞生命活动中起关键作用的酶，其主要功能是解决DNA的拓扑应力，包括DNA复制、转录、重组以及染色质重塑等过程。这些酶通过暂时切割DNA的一条或两条链，然后重新连接，从而缓解DNA的扭力和缠绕，确保DNA和RNA的结构完整性。在人类细胞中，共有六种不同的拓扑异构酶，它们在执行类似功能的同时，也具有一定的特异性，以应对不同的拓扑问题和细胞环境。为了深入了解这些酶的相互作用及其在DNA损伤修复中的角色，研究人员通过全面的蛋白质组学分析，构建了人类拓扑异构酶相关蛋白的相互作用网络。这一研究不仅揭示了这些酶在不同条件下的动态变化，还可能为癌症治疗中拓扑异构酶抑制剂的应用提供新的生物标志物或治疗靶点。

在本研究中，研究人员采用了串联亲和纯化（TAP）结合质谱分析的方法，分别在正常和应激条件下对五种人类拓扑异构酶（排除线粒体拓扑异构酶TOP1）进行了蛋白相互作用网络的绘制。通过这种方法，他们发现了多个关键的相互作用，其中TOP1与PUM3的相互作用尤为显著。PUM3在细胞受到TOP1抑制剂处理后，会从核仁迁移至核质，这一现象提示了TOP1与PUM3之间可能存在某种调控关系。此外，研究还揭示了TOP3A与NSMCE4A、YTHDC2和NDUFAF7之间的新相互作用，以及TOP3B与线粒体膜蛋白TDRKH（也称为TDRD2）之间的一种未被表征的相互作用。这些发现为理解拓扑异构酶的调控机制和功能协调提供了新的视角，同时为癌症治疗中的拓扑异构酶抑制剂开发提供了潜在的靶点。

研究人员进一步探讨了这些相互作用在TOP1和TOP2抑制剂处理以及复制应激条件下的动态变化，区分了染色质和可溶性蛋白组分中的相互作用。这种研究方法有助于揭示拓扑异构酶在维持基因组稳定性中的作用，以及它们如何在不同细胞环境下协调功能。此外，研究还指出，某些相互作用可能与DNA损伤修复机制相关，而其他相互作用可能与RNA代谢或染色质调节有关。这些发现不仅扩展了对拓扑异构酶功能的理解，也为相关疾病的治疗策略提供了新的思路。

为了验证这些相互作用，研究人员进行了免疫共沉淀和Western blot分析，以确认TOP1与PUM3之间的稳定相互作用。此外，他们还通过细胞存活率实验，评估了PUM3缺失对细胞对TOP1抑制剂敏感性的影响，结果显示PUM3缺失使细胞对某些DNA损伤药物表现出更强的耐药性，这一现象与之前的研究结果有所不同，可能与实验方法和细胞系的差异有关。尽管如此，这些结果表明PUM3的重新定位可能是TOP1抑制剂处理的直接结果，而不是DNA损伤反应的一部分。

研究还发现，TOP1的相互作用网络在DNA损伤处理后没有显著变化，但某些DNA修复蛋白与TOP1的相互作用增强了，这可能表明TOP1在DNA损伤修复过程中发挥一定的辅助作用。此外，TOP1与RCL1和EFTUD2的相互作用在CPT处理后减弱，这可能与这些蛋白的表达水平或功能需求变化有关。TOP1与这些蛋白的相互作用变化提示了其在RNA代谢中的潜在作用，尤其是在DNA复制受阻的情况下。

在TOP2A和TOP2B的相互作用网络中，研究人员发现了ZNF451和TRIM38等新蛋白。ZNF451是一种E3泛素连接酶，能够通过泛素化调控TOP2A和TOP2B的活性，而TRIM38则可能在拓扑异构酶II的调控中发挥重要作用。这些相互作用可能与DNA修复、染色质重塑等过程相关。然而，这些相互作用在不同的细胞处理条件下表现出不同的动态变化，表明它们可能具有不同的功能角色。

TOP3A的相互作用网络显示，它与NSMCE4A、YTHDC2和NDUFAF7等蛋白有显著的相互作用。NSMCE4A是SMC5/6复合体的一部分，该复合体在DNA修复过程中起关键作用。YTHDC2则是一种m6A修饰RNA的阅读蛋白，其与TOP3A的相互作用可能暗示TOP3A在RNA代谢中的新功能。尽管这些相互作用可能涉及不同的生物学过程，但它们共同强调了TOP3A在DNA修复和RNA调控中的重要作用。

TOP3B的相互作用网络揭示了其与TDRKH的关联，TDRKH是一种富含Tudor结构域的蛋白，主要在睾丸中表达，与精子发生和男性生育有关。此外，TOP3B还与TDRD3形成稳定的复合体，而TIPRL则可能通过调节ATM/ATR信号通路影响DNA复制和修复。这些发现提示了TOP3B在细胞不同功能中的潜在作用，尤其是在线粒体相关的过程中。

本研究的局限性在于，为了减少非特异性相互作用，研究人员采用了严格的筛选标准，这可能导致一些较弱但重要的相互作用被排除。此外，实验中使用的蛋白质表达水平可能影响相互作用的检测效率，特别是对于那些在生理条件下表达水平较低的蛋白。因此，未来的研究需要利用更合适的模型，如基于CRISPR的亲和标签插入技术，以进一步验证和扩展这些发现。

总体而言，这项研究为理解拓扑异构酶的相互作用及其在DNA损伤修复、RNA代谢和染色质调节中的功能提供了新的视角。通过全面的蛋白质组学分析，研究人员不仅揭示了拓扑异构酶的相互作用网络，还发现了潜在的新功能和调控机制。这些发现为拓扑异构酶在癌症治疗中的应用提供了重要的理论基础和实验依据，同时也为未来的研究提供了宝贵的资源和方向。