稳定性测试发现，重链C末端氨基酸的光选择性剪切会导致抗体Fab片段的断裂和聚集

《Molecular Pharmaceutics》：Stability Testing Reveals Photoselective Clipping of Heavy Chain C?Terminal Amino Acids That Leads to Fragmentation and Aggregation of an Antibody Fab Fragment

　　抗体片段A33 Fab在复合应力下的稳定性分析显示，UV至蓝光诱导重链C末端光化学截断，加速片段化和聚集。实验采用多因素正交设计，在硅化聚丙烯微孔板中考察温度（4-45℃）、LED光源（UV/蓝/绿/橙/白）、表面活性剂（0.26% Tween80）及摇动（600rpm）的交互作用。质谱分析发现重链C端每两氨基酸发生截断，形成142/188/239Da的阶梯式质量损失，证实存在光敏性芳香族氨基酸簇（Trp/Y/Tyr/Phe）介导的链式降解。动态光散射（DLS）显示硅化板促进大颗粒聚集，而Tween80通过表面吸附抑制聚集（抑制率52.3%），但显著加剧蓝光（4.1cd）和UV（1285cd）下的光氧化损伤。N末端测序证实未发生N端修饰。建议最佳储存条件为：pH5.5、4℃黑暗环境、硅化容器需配合2%以上Tween80，运输中应避免LED光照和硅油接触。

　　在生物制药领域，抗体片段的稳定性研究对于确保其安全性和有效性至关重要。A33 Fab作为一种潜在的免疫治疗药物，被设计用于靶向人类A33抗原，该抗原在结直肠癌的原发和转移性病变中广泛存在。A33 Fab具有已知的X射线晶体结构，因此其稳定性研究对于理解其在储存和运输过程中可能面临的挑战具有重要意义。为了模拟真实世界中抗体片段可能遇到的环境压力，研究者开发了一种定制设备，结合了pH值、温度、搅拌以及基于LED的光照条件，用于在聚丙烯微孔板中对A33 Fab进行受控应力实验。这种设备的应用，使得能够更准确地评估抗体片段在实际应用中的稳定性，特别是针对其可能发生的降解途径。

研究中采用了一系列实验手段，包括尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC）用于监测单体损失和片段化，动态光散射（DLS）用于评估聚合物的形成以及其粒径的变化，以及完整的质谱分析（LC-MS）和N端序列分析，用于识别化学修饰。研究发现，光照条件，尤其是紫外线到蓝光范围内的光照，往往与其他因素相互作用，导致化学降解。这种降解不仅增加了蛋白质聚集的易感性，还特别在高温条件下更为显著。有趣的是，尽管Tween 80作为非离子型表面活性剂在防止聚集方面表现出一定的保护作用，尤其是在硅化处理的微孔板中，但其在光照条件下也促进了单体的损失，这与之前的研究结果一致，表明Tween 80可能在某些情况下充当光敏剂，诱导蛋白质降解。

进一步研究发现，A33 Fab在光照条件下表现出特定的氨基酸剪切现象，这种剪切主要发生在重链的C端区域。这表明重链C端可能存在一个对光敏感的热点区域，该区域在光照作用下更容易发生化学反应，导致片段化和聚集。这些结果与之前的研究相呼应，其中发现重链铰链区域的柔性抑制突变能够显著降低聚集的速率。因此，A33 Fab的稳定性不仅受到物理条件的影响，还受到化学因素的制约，特别是光照和表面活性剂的存在。

在材料和方法部分，研究者详细描述了实验所用的材料和制备过程。Tween 80、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠盐、硅油、乙酸铵和氯化钠均从Merck公司购买。A33 Fab在大肠杆菌W3110中表达，并通过Protein G层析和凝胶过滤进行纯化。纯化后的蛋白质被交换至超纯水中，并在4°C下浓缩至36.75 mg/mL。在实验过程中，研究者采用了不同pH值的磷酸缓冲液（pH 7.5或5.5），以及是否添加0.26%（w/v）Tween 80。这些条件旨在模拟实际储存和运输过程中可能遇到的各种情况。

为了模拟储存和运输中的机械应力，研究者使用了聚丙烯微孔板，并测试了不同条件下的光照、温度和搅拌对A33 Fab稳定性的影响。实验结果显示，光的暴露条件，尤其是蓝光、白光和紫外线，对单体损失和聚合物形成具有显著影响。在21°C下，这些光暴露条件导致了A33 Fab的显著质量损失，这种损失可以通过LC-MS检测到，并与单体的片段化相关联。值得注意的是，蓝光在某些条件下不仅导致了质量损失，还促进了更小的分子量片段的形成，这可能与光诱导的肽键断裂有关。此外，研究者还发现， Tween 80在某些情况下可能加剧了光诱导的降解，特别是在蓝光和白光暴露条件下。

在结果与讨论部分，研究者分析了光照条件对A33 Fab的影响，并探讨了其与温度、pH值和表面活性剂的相互作用。实验数据显示，蓝光和白光在特定条件下显著增加了单体的损失，并导致了更大的粒子形成。相比之下，红光和绿光对单体损失的影响较小，但在某些情况下仍能观察到微小的变化。这些发现表明，不同波长的光对蛋白质的降解具有不同的影响，且某些波长的光更容易引发化学反应，从而导致蛋白质的结构改变。

研究还探讨了Tween 80在光照条件下的作用机制。尽管Tween 80在防止聚集方面表现出一定的保护作用，但在某些情况下，其可能促进光诱导的降解。这与之前的研究结果一致，表明Tween 80可能通过光降解产生活性氧物种，进而导致蛋白质的氧化。此外，硅化微孔板的使用也对聚合物的形成产生了影响，尤其是在高温条件下，硅化处理的微孔板更容易导致大粒子的形成，而未硅化的微孔板则表现出较低的单体损失和较小的粒子形成。

N端序列分析进一步验证了A33 Fab在光照条件下的降解情况。尽管某些受光影响的样品显示出较高的单体损失，但N端序列分析并未发现明显的N端氨基酸剪切现象，这表明降解主要发生在C端区域。这一发现为理解A33 Fab在光照下的降解机制提供了重要线索，即重链C端区域可能是主要的光敏感区域。

综上所述，该研究揭示了光照条件对A33 Fab稳定性的影响，特别是其在UV-A波段的光敏感性。研究还表明，Tween 80虽然在某些情况下有助于防止大粒子的形成，但其可能促进光诱导的降解。此外，硅化处理的微孔板在高温条件下可能导致更多的聚合物形成，而未硅化的微孔板则相对稳定。因此，为了确保A33 Fab的稳定性和有效性，其储存和运输应尽量避免光照，特别是在UV-A波段，同时应避免使用硅化处理的微孔板，或在必须使用时加入适量的Tween 80以减少大粒子的形成。此外，储存温度应保持在较低水平，以减少单体的损失和聚合物的形成。这些发现对于抗体片段的储存和运输条件优化具有重要的指导意义。