功能分析：意义不明的罕见RAS变异体 开放获取

《Cancer Research Communications》：Functional Analysis of Rare RAS Variants of Unknown Significance Open Access

　　研究通过功能分析评估了298个罕见K/N/HRAS变体的致癌潜力，并测试其对非共价pan-KRAS抑制剂BI-2865的敏感性。主要发现包括15个KRAS变体对BI-2865敏感，66个新鉴定致癌变体，以及结构改变导致药物抵抗的机制分析。研究揭示了RAS变体功能与临床治疗的相关性，为个性化治疗提供依据。

　　本研究聚焦于罕见的RAS基因变异及其在癌症治疗中的潜在作用。RAS基因家族，包括KRAS、NRAS和HRAS，是人类癌症中最常见的突变靶点之一。这些基因的突变会导致细胞信号传导的异常，进而推动肿瘤的形成和生长。尽管频繁出现的RAS突变已被广泛研究并明确了其在肿瘤发生中的功能意义，但罕见变异的功能及其临床重要性仍然未被充分理解。本研究旨在通过高通量功能分析，揭示这些罕见变异的生物学特性，并评估其对药物治疗的敏感性，为RAS驱动型癌症的个性化治疗提供新的思路。

RAS蛋白作为小GTP结合蛋白，其活性状态的切换是细胞信号传导的重要机制。当RAS结合GDP时，处于“关闭”状态，而通过GTP的结合，它会转变为“开启”状态，从而激活下游信号通路，如MAPK和PI3K通路，促进细胞增殖和生存。RAS蛋白的活性状态依赖于GTP的交换与水解，而某些突变会影响这一过程，导致RAS持续处于激活状态，从而引发癌症。例如，G12和G13位点的突变主要影响GAP介导的GTP水解，而Q61位点的突变则干扰RAS自身的GTP水解能力，使其难以返回非活性状态。这些已知的“经典”突变已被证实具有强烈的致癌能力，但在临床实践中，许多患者携带的是罕见的RAS变异，这些变异的功能和对治疗的反应尚未被系统研究。

本研究选择了298种K/N/HRAS变异，其中包括169种KRAS变异、72种NRAS变异和57种HRAS变异，这些数据来源于COSMIC数据库v100和GENIE 16.0-public数据库。通过将这些变异导入3T3细胞，并使用“混合所有提名于一个”（MANO）方法评估其转化能力以及对BI-2865这种非共价型广谱KRAS抑制剂的敏感性。研究结果显示，共有35种KRAS变异、10种NRAS变异和21种HRAS变异被鉴定为具有转化能力的变异。此外，研究还发现了15种KRAS变异对BI-2865表现出敏感性，这些变异的细胞在药物处理后出现了显著的凋亡现象，并且RAS下游信号通路的激活被有效抑制。这表明，这些罕见变异可能在某些情况下成为潜在的治疗靶点。

研究进一步发现，共有66种新的致癌性RAS变异被识别出来。这些变异的药物敏感性存在显著差异，意味着针对不同RAS变异的个体化治疗策略可能是必要的。BI-2865作为一种非共价型广谱KRAS抑制剂，其作用机制可能涉及对RAS蛋白的结构改变，从而影响其信号传导能力。然而，一些罕见变异可能因为结构上的改变，导致药物无法有效结合，从而表现出对BI-2865的耐药性。例如，G13P突变被认为通过影响P-loop的构象，导致GTP水解能力下降，使KRAS蛋白持续处于活性状态，进而抵抗药物作用。类似的，位于开关II区域的插入或重复突变，如T50_E63dup、L52_G60dup等，可能破坏药物结合位点的结构，使药物无法有效发挥作用。

本研究的发现为RAS变异的临床评估提供了重要的参考。传统上，RAS突变的治疗策略主要集中在G12、G13和Q61等“经典”位点，而这些研究往往忽略了罕见变异的潜在影响。通过使用MANO方法，本研究不仅评估了这些变异的转化能力，还通过药物敏感性实验，揭示了它们对BI-2865的反应差异。这种系统性的功能分析有助于理解不同RAS变异在肿瘤发生和治疗反应中的作用，并为开发针对这些变异的新型药物提供了依据。

在药物敏感性实验中，研究团队利用3T3细胞进行实验，通过不同浓度的BI-2865处理，观察其对细胞存活率的影响。结果显示，一些KRAS变异对BI-2865表现出高度敏感性，而另一些则表现出显著的耐药性。这种差异可能与变异的位置、类型以及对RAS蛋白构象的影响有关。例如，G12A、G12C、G12D、G12E、G13C、G13D、G13F、G13Y、Q61P和K117Y等变异在药物处理后表现出更高的细胞死亡率，表明这些变异可能对BI-2865具有良好的反应性。相反，G12R和Q61L/R/K等变异则表现出较强的耐药性，这可能与其显著降低GTP水解活性有关。

此外，研究还发现了一些新的敏感变异，如G12_G13delinsAC、G13F/Y、L19_T20delinsFS、A59_G60delinsGV和K117Y。这些变异在OncoKB和ClinVar数据库中被归类为变异功能未知（VUS），且在COSMIC数据库中的记录数量较少。这表明，这些变异在临床实践中可能被低估，但它们的潜在治疗价值值得进一步探索。通过Western blot分析，研究团队进一步验证了这些变异对下游信号通路的影响，发现敏感变异在药物处理后表现出MEK1/2的磷酸化减少，以及促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达增加，进一步支持了这些变异对BI-2865的敏感性。

本研究的成果不仅揭示了罕见RAS变异的功能特性，还为未来的个性化治疗策略提供了重要线索。在当前的癌症治疗中，许多药物针对的是已知的“经典”RAS突变，而罕见变异可能代表了新的治疗靶点。因此，针对这些变异开发新的抑制剂或靶向药物，可能是未来抗癌药物研发的重要方向。同时，研究也强调了药物敏感性评估的重要性，因为不同RAS变异对药物的反应可能截然不同，这要求在临床治疗中根据具体的基因变异类型选择合适的药物。

值得注意的是，尽管本研究的发现具有重要的科学意义，但仍存在一些局限性。首先，3T3细胞转化实验虽然是一种常用的方法，但其结果可能受到细胞类型和培养条件的影响，因此在不同的细胞系或组织背景下，这些变异的功能可能有所不同。其次，RAS蛋白的过度表达可能会影响实验结果，因为通过逆转录病毒转染的细胞中，RAS蛋白的水平通常高于内源性表达。虽然野生型RAS在3T3细胞中不表现出转化能力，但其他细胞类型可能表现出不同的行为。最后，本研究的药物敏感性数据尚未在临床实践中得到验证，因此需要进一步的临床试验来确认这些变异对治疗的实际影响。此外，一些其他基因突变，如TP53和PIK3CA突变，可能与RAS突变共存，并影响药物的疗效，这些因素在本研究中未被充分考虑。

综上所述，本研究通过高通量功能分析，揭示了罕见RAS变异的转化潜力及其对BI-2865的敏感性，为RAS驱动型癌症的治疗提供了新的视角。这些发现不仅有助于理解RAS变异在肿瘤发生中的作用，也为未来开发针对罕见变异的靶向药物提供了理论依据。同时，研究也强调了在临床治疗中，需要针对不同RAS变异进行个体化评估，以提高治疗效果和患者的生存率。随着更多新型药物和靶向策略的出现，RAS基因变异的全面功能分析将成为癌症精准治疗的重要组成部分。