KRAS变异体对BI-2865的耐药性。A，3T3细胞…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：Drug sensitivity of KRAS variants to BI-2865. A, 3T3 cel... Open Access

　　基因突变功能研究与药物敏感性分析为RAS驱动癌症的个体化治疗提供依据。本研究通过焦点形成实验和混合提名单细胞法（MANO），系统评估了298个KRAS/NRAS/HRAS罕见变异的转化活性和对非共价全RAS抑制剂BI-2865的敏感性。创新性发现35个KRAS、10个NRAS和21个HRAS罕见变异具有显著致癌性，其中15个KRAS变异对BI-2865敏感（IC50≤1 μM），其下游MAPK/PI3K信号通路抑制和凋亡诱导效果与临床前模型一致。研究揭示了RAS蛋白G域结构域（尤其是开关区域I和II）的构象变化是决定药物敏感性的关键机制，为开发靶向罕见RAS突变的精准疗法奠定基础。

　　在人类癌症研究中，RAS基因家族（包括KRAS、NRAS和HRAS）因其在肿瘤发生中的关键作用而备受关注。这些基因的突变与多种癌症类型密切相关，尤其是在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中。尽管已知频繁发生的RAS突变具有显著的致癌效应，但罕见突变的功能和临床意义尚未被充分研究。本研究旨在通过高通量功能分析方法，全面评估这些罕见RAS变异体的致癌潜能和对新型KRAS抑制剂BI-2865的敏感性，从而为RAS驱动型癌症的个性化治疗提供新的视角和线索。

### RAS基因在癌症中的重要性

RAS基因家族编码的小GTP结合蛋白在细胞信号传导中扮演着核心角色。这些蛋白通过其在GTP结合状态和GDP结合状态之间的切换，调控细胞的增殖、分化和存活等关键过程。在正常细胞中，KRAS在GDP结合状态下处于“关闭”状态，当细胞受到生长因子或SOS1/SOS2等交换因子的刺激时，KRAS会转化为GTP结合的“开启”状态，进而激活下游的信号通路，如MAPK和PI3K通路。然而，当KRAS突变导致其无法正常进行GTP水解时，就会持续处于激活状态，从而促进肿瘤的形成和生长。

在癌症中，KRAS、NRAS和HRAS的突变频率各不相同。其中，KRAS是最常见的致癌突变，尤其在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中占据主导地位。而NRAS和HRAS的突变虽然相对较少，但在某些特定癌症类型中具有重要影响，例如皮肤癌和甲状腺癌中NRAS突变较为常见，而HRAS突变则更多出现在膀胱癌和头颈癌中。这些突变的分布模式与肿瘤的发生机制密切相关，也为理解不同癌症类型中RAS突变的生物学功能提供了基础。

### 罕见RAS变异体的鉴定与功能分析

为了全面了解罕见RAS变异体的致癌潜能，本研究从COSMIC数据库（v100）中选取了298种K/N/HRAS变异体，其中包括169种KRAS、72种NRAS和57种HRAS变异体。随后，这些变异体被引入3T3细胞中，以评估其转化能力。通过使用一种称为“混合所有提名在一个”（MANO）的方法，研究人员能够高效地检测不同RAS变异体的功能特性。该方法通过将携带不同变异体的细胞混合培养，结合条形码序列追踪技术，评估变异体的增殖能力和转化潜能。

研究结果显示，共有35种KRAS、10种NRAS和21种HRAS变异体被鉴定为具有转化能力的变异体。这些变异体在3T3细胞中表现出不同程度的增殖优势，其中FFA（焦点形成试验）评分越高，表明其转化能力越强。评分3和4的变异体显示出显著的致癌特性，而评分2的变异体则表现出与野生型KRAS相似的转化能力。这些结果与COSMIC数据库中的现有数据一致，表明研究方法的有效性。

此外，研究还发现，有66种新的致癌性RAS变异体被鉴定出来。其中，15种KRAS变异体对BI-2865表现出敏感性，而其他变异体则对药物不敏感。这表明，不同RAS变异体对KRAS抑制剂的反应存在显著差异，这种差异可能与变异体的具体位置、突变类型以及其对GTP结合和水解过程的影响有关。例如，某些突变可能影响GTP水解效率，而另一些突变可能改变KRAS蛋白的结构，从而影响其与抑制剂的结合能力。

### BI-2865的药效与作用机制

BI-2865是一种非共价的广谱KRAS抑制剂，能够在多种KRAS变异体中发挥作用。在本研究中，研究人员通过体外药敏试验评估了不同KRAS变异体对BI-2865的敏感性。结果表明，某些KRAS变异体对BI-2865表现出显著的抑制效应，而其他变异体则表现出较强的耐药性。这一发现具有重要的临床意义，因为它表明，对于携带不同KRAS变异体的患者，需要根据其具体的突变类型选择最合适的治疗方案。

进一步的Western blot分析显示，BI-2865能够有效抑制KRAS变异体下游的信号通路，如MEK1/2的磷酸化，并诱导细胞凋亡。这一机制表明，BI-2865不仅能够阻止KRAS变异体的持续激活，还能够通过触发细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。然而，某些变异体，如G12R和Q61L/R/K，由于显著降低GTP酶活性，导致其对BI-2865表现出较高的耐药性。这提示，药物敏感性与变异体的GTP酶活性密切相关。

### 罕见变异体的临床意义

本研究不仅揭示了罕见RAS变异体的致癌潜能，还评估了它们对BI-2865的敏感性。这一发现为临床治疗提供了新的思路。例如，某些罕见变异体（如G12E、G13F/Y、L19_T20delinsFS等）虽然在COSMIC数据库中报告的病例数较少，但被鉴定为对BI-2865敏感的变异体。这些变异体的发现意味着，未来可能针对这些罕见突变开发更具针对性的治疗策略，从而提高治疗效果。

此外，研究还指出，某些罕见变异体可能具有特定的耐药机制。例如，G13P突变通过影响P-loop的结构，导致GTP酶活性降低，从而使得KRAS持续处于激活状态，进而对BI-2865产生耐药性。同样，插入或重复突变可能通过改变KRAS蛋白的结构，干扰其与抑制剂的结合，从而降低药物疗效。这些机制提示，针对不同类型的RAS变异体，需要开发不同的治疗策略，以应对其在细胞内可能产生的结构和功能变化。

### 个性化治疗的前景

本研究的结果表明，针对RAS驱动型癌症的个性化治疗策略是可行的。由于不同RAS变异体对药物的反应存在显著差异，因此在临床实践中，需要对患者的具体突变类型进行详细分析，以选择最有效的治疗方案。例如，对于携带KRAS G12C突变的患者，目前已有两种FDA批准的靶向药物——sotorasib和adagrasib。然而，这些药物仅适用于G12C突变，而其他类型的KRAS突变（如G12D、G12V等）则需要不同的药物或治疗策略。

本研究发现，BI-2865对某些罕见KRAS突变具有一定的疗效，这为开发新的KRAS抑制剂提供了理论依据。同时，研究也指出，针对非G12C突变的KRAS抑制剂或蛋白降解剂（如ASP3082和RMC-6236）的研发是当前的重要方向。这些药物能够在更广泛的KRAS突变中发挥作用，从而拓宽治疗的适用范围。

### 潜在的局限性与未来方向

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，使用3T3细胞进行焦点形成试验是一种经典的评估转化潜能的方法，但其是否适用于其他细胞类型仍需进一步验证。因此，未来的研究应考虑在不同的细胞背景下评估RAS变异体的功能，以确认这些变异体的转化能力是否具有普遍性。

其次，通过逆转录病毒载体将RAS变异体引入细胞，可能会导致RAS蛋白的过表达，这与内源性RAS表达不同。因此，需要进一步研究这种过表达是否会影响变异体的功能特性。此外，本研究的药敏数据尚未在临床中得到验证，因此需要在大规模临床试验中进一步评估这些变异体对药物的反应情况。

最后，RAS突变常常与其他基因突变（如TP53和PIK3CA）共存，这些共存突变可能影响药物的疗效。因此，在未来的研究中，应考虑这些协同作用，以更全面地理解RAS变异体在肿瘤中的功能和治疗反应。

### 结论

本研究首次通过高通量功能分析方法，全面评估了298种罕见RAS变异体的致癌潜能和对BI-2865的敏感性。研究结果不仅为RAS驱动型癌症的个性化治疗提供了新的线索，还揭示了不同RAS变异体对药物反应的多样性。这表明，未来的治疗策略应更加关注变异体的特异性，以提高治疗的有效性和针对性。此外，研究还强调了开发新型KRAS抑制剂和蛋白降解剂的必要性，以应对不同类型的RAS突变。这些发现为癌症研究和临床治疗提供了重要的理论基础和实践指导。