Lollipop图表及RAS变体的转化活性…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：Lollipop chart and transforming activity of RAS variants. ... Open Access

　　RAS基因罕见突变的功能分析与药物敏感性研究显示，通过混合提名单细胞法（MANO）评估了298个K/N/HRAS变体，发现66个新致癌突变，其中15个对非共价pan-KRAS抑制剂BI-2865敏感，且敏感性与GTP酶活性相关。研究建立了变体分类与靶向治疗的新框架。

　　在人类癌症中，RAS基因家族因其频繁的突变而备受关注。RAS基因包括KRAS、NRAS和HRAS三种主要的等位基因，它们在细胞信号传导过程中扮演关键角色。这些基因的突变可能导致癌细胞获得持续的增殖能力，从而推动肿瘤的生长和扩散。尽管常见突变（如G12、G13和Q61）的生物学功能和临床意义已经被广泛研究，但关于罕见突变的影响仍知之甚少。本研究通过一种创新的高通量筛选方法，对298种罕见RAS突变（包括169种KRAS、72种NRAS和57种HRAS突变）进行了功能评估，并首次全面分析了它们对一种名为BI-2865的非共价广谱KRAS抑制剂的敏感性。这些发现不仅有助于理解RAS突变的生物学意义，还为针对这些突变的个性化治疗提供了重要线索。

### RAS基因突变的普遍性与功能

RAS基因突变在多种癌症类型中都较为常见，尤其在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中更为突出。例如，在胰腺癌中，KRAS突变的发生率高达90%，而在结直肠癌中约为50%，肺癌中约为30%。然而，这些常见突变已经得到了充分的功能验证和临床应用，相比之下，罕见突变的功能和临床相关性仍然模糊不清。RAS蛋白是一种小GTP结合蛋白，其在细胞内的活性受到GTP与GDP之间转换的调控。当RAS蛋白结合GDP时，它处于“关闭”状态，而结合GTP时则处于“开启”状态。这一动态变化是细胞信号传导的关键环节，而突变可能干扰这一过程，使RAS蛋白持续处于“开启”状态，从而促进肿瘤的发生。

本研究中，通过引入298种罕见RAS突变至3T3细胞，并使用焦点形成（FFA）实验评估其转化能力，我们识别出35种KRAS突变、10种NRAS突变和21种HRAS突变具有转化潜能。这些结果与数据库中的已知信息一致，表明该研究在功能性分析方面具有可靠性。此外，我们还发现，其中66种RAS突变是新的致癌性突变，而15种KRAS突变对BI-2865表现出显著的敏感性。BI-2865能够抑制RAS下游信号通路，并诱导具有敏感突变的细胞发生凋亡，这表明该药物可能对某些RAS突变的癌症具有治疗潜力。

### RAS突变的分布与特征

在研究中，我们还对RAS突变在不同癌症类型中的分布进行了分析。根据C-CAT数据库，RAS突变在胰腺癌中的发生率最高，达到80%；其次是结直肠癌（59%）、胆道癌（29%）、卵巢/输卵管癌（19%）和肺癌（16%）。从突变类型来看，KRAS突变主要集中在GTP结合域，如G12、G13和Q61位点，这些突变通常与肿瘤的驱动能力密切相关。相比之下，非典型突变（如T50、T58、G60、F90、F156和R164）在某些癌症类型中更为常见，例如胆道癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和软组织肉瘤。这表明RAS突变的分布不仅与癌症类型相关，还可能因突变的具体位置和类型而有所不同。

此外，我们还注意到一些特定的RAS突变在某些癌症中更为突出。例如，在肺癌中，KRAS G12C突变是第二常见的突变类型，而胰腺癌中该突变的发生率仅为2.0%。在结直肠癌中，KRAS G13D突变较为常见，而在宫颈癌中，KRAS G13D突变的发生率高达16.0%。NRAS突变在皮肤癌和甲状腺癌中更为常见，而HRAS突变则主要出现在前列腺癌和头颈癌中。这些结果与之前的研究相吻合，进一步验证了RAS突变在不同癌症中的特异性。

### BI-2865对KRAS突变的敏感性分析

为了评估BI-2865对不同KRAS突变的抑制效果，我们使用了一种名为MANO的高通量方法。这种方法通过将携带不同RAS突变的3T3细胞混合，并在不同浓度的BI-2865作用下进行培养，最终通过细胞活力检测和焦点形成实验来评估其敏感性。结果显示，一些KRAS突变对BI-2865表现出较高的敏感性，而另一些则显示出显著的耐药性。例如，KRAS G12A、G12C、G12D、G12E、G13C、G13D、G13F、G13Y、Q61P和K117Y等突变对BI-2865表现出较高的敏感性，而KRAS G12R和Q61L/R/K等突变则对药物具有显著的耐药性。

在这些耐药性突变中，G13P是一种点突变，它可能通过降低GTP酶活性来影响药物效果。G13P突变将甘氨酸替换为脯氨酸，而甘氨酸是一种小、灵活且非极性的氨基酸，脯氨酸则是一种结构较为刚性的氨基酸。这种替换可能导致P-loop区域的构象受限，从而影响GTP的水解效率。P-loop是RAS蛋白中负责稳定GTP分子磷酸基团的关键区域，其结构变化可能直接影响GTP酶活性，进而影响RAS蛋白的激活状态。此外，某些插入或重复突变也可能通过改变KRAS蛋白的构象，导致其无法被BI-2865有效结合，从而产生耐药性。

### 药物敏感性与临床意义

研究发现，某些罕见的KRAS突变可能对BI-2865表现出显著的敏感性，而这些突变在之前的数据库中并未被充分记录。例如，G12_G13delinsAC、G12E、G13F/Y、L19_T20delinsFS、A59_G60delinsGV、K117Y等突变在OncoKB和ClinVar中被归类为变异功能未知（VUS），并且在COSMIC数据库中仅报告了少数病例。这些结果表明，即使是罕见的RAS突变，也可能具有重要的临床意义，特别是在开发新的靶向治疗策略方面。

值得注意的是，尽管BI-2865对某些KRAS突变表现出良好的抑制效果，但目前尚未有相关的临床试验进行验证。然而，该药物的结构类似物BI-2493已经在小鼠模型中显示出对KRAS G12C、G12D、G12V和A146V等突变的抑制效果，这表明BI-2865及其类似物可能在未来的临床研究中具有应用前景。此外，其他新型KRAS抑制剂（如Divarasib、Olomorasib）也正在临床试验中进行评估，显示出对KRAS突变的治疗潜力。

### 未来研究方向与挑战

尽管本研究为RAS突变的功能分析提供了重要线索，但仍存在一些局限性。首先，3T3细胞系虽然常用于评估RAS突变的转化能力，但其可能无法完全反映不同组织类型中RAS突变的真实生物学行为。因此，未来的研究需要在更多细胞类型中进行验证，以确定这些突变是否具有组织特异性或普遍性。其次，使用逆转录病毒载体引入突变可能导致RAS蛋白的过表达，而过表达的野生型RAS并不具备转化能力。因此，需要进一步研究RAS突变在不同细胞环境下的表达水平及其对细胞行为的影响。此外，本研究未考虑其他可能影响药物敏感性的基因突变，如TP53和PIK3CA等。这些基因突变可能与RAS突变共存，并影响癌症对治疗的反应。

### 结论与展望

综上所述，本研究首次对298种罕见RAS突变进行了功能评估，并揭示了其中66种新的致癌性突变。同时，我们还发现15种KRAS突变对BI-2865表现出显著的敏感性，这为针对这些突变的个性化治疗提供了理论依据。然而，这些结果仍需通过临床试验进行验证，特别是在罕见突变的治疗策略方面，需要更多的数据支持。未来的研究应结合临床样本，进一步探索RAS突变在不同癌症类型中的作用，并开发更有效的靶向药物。此外，随着基因组学和分子生物学技术的进步，我们有望更全面地理解RAS突变的生物学机制，并为癌症患者提供更加精准的治疗方案。