基于dCas13a系统和铱复合体的链式精准扩增生物传感器，用于microRNA检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Chain-based precision amplification biosensor for microRNA detection based on dCas13a system and iridium complex

　　本研究开发了一种基于dCas13a系统和铱配合物的多通道链式精密放大光电化学生物传感器，用于同时检测多种miRNA。通过长双链核酸链实现信号放大，检测极限低至aM级别，临床样本测试验证了实用性。

　　近年来，随着对多种微小RNA（miRNA）异常表达与多种疾病之间密切关系的认识不断加深，miRNA的多通道检测在疾病诊断中变得愈发重要。然而，传统miRNA检测方法在实现所需的特异性、灵敏度以及多通道检测能力方面存在明显不足。为了解决这一挑战，我们开发了一种基于dCas13a系统和铱（Ir）配合物的链式精准放大光电化学（PEC）生物传感器，用于同时检测多种miRNA。该传感器通过dCas13a-crRNA复合物实现对miRNA的精准识别，并将其转化为由长双链核酸链上附着的铱纳米复合物产生的显著光电流响应，从而实现信号放大，即链式精准放大。dCas13a-crRNA复合物被修饰在多通道电极上，以同时识别和结合多种目标miRNA。铱配合物被修饰在能级匹配的量子点表面，以抑制载流子复合，同时进一步在量子点表面修饰金纳米颗粒，从而构建出高效的光电转换纳米复合物。在miRNA的3'端构建双链序列，以增加纳米复合物的附着位点。该生物传感器表现出卓越的特异性和灵敏度，能够区分单碱基差异，检测限低至亚摩尔（aM）级别，这得益于链式精准放大技术。此外，临床样本测试强调了该生物传感器在临床诊断中的实际应用价值。这种多通道链式精准放大生物传感器为同时检测多种miRNA提供了一种极具价值和创新性的方法，在临床诊断领域展现出广阔的应用前景。

miRNA是一类高度保守的小型非编码RNA，通常由18到23个核苷酸组成。尽管miRNA仅占真核生物基因组的1%到2%，但它们能够调控约30%的蛋白质编码基因的表达。近年来的研究表明，miRNA在多种生物学过程中发挥着至关重要的调控作用，包括生物发育、器官生成、造血、病毒防御以及脂质代谢等。因此，2024年的诺贝尔生理学或医学奖被授予Victor Ambros和Gary Bruce Ruvkun，以表彰他们对miRNA及其在转录后基因调控中的作用的发现。由于miRNA具有复杂多样的功能，它们与多种医学状况密切相关，包括癌症、传染病、免疫紊乱、心血管和脑血管疾病以及不孕症等。作为疾病诊断的潜在生物标志物，miRNA正逐渐受到重视，使得其检测在临床应用中变得至关重要。

一些疾病，如癌症和心血管疾病，与多种miRNA的异常表达密切相关，因此实现miRNA的多通道检测具有极高的价值。与单通道方法相比，多通道miRNA检测能够更高效地识别特定疾病相关的miRNA表达谱。然而，传统miRNA检测方法仍然存在显著的局限性。尽管实时聚合酶链反应（RT-PCR）在灵敏度和特异性方面表现出色，但其多通道检测能力受到可用荧光探针种类的限制。平面微阵列和Northern blotting技术能够同时检测多种miRNA，但它们的灵敏度和特异性较差。在多通道检测方面，近年来出现的一些新型miRNA检测技术展示了创新性的突破。然而，这些技术仍然不可避免地面临与传统方法相似的局限和挑战。因此，开发一种高特异性、高灵敏度的多通道miRNA检测方法对于miRNA分析至关重要。

光电化学（PEC）分析是一种具有前景和创新性的生物传感方法。PEC系统中，激发源（光）与检测信号（电）的完全分离，使得其能够实现低背景噪声和高灵敏度。PEC系统的性能，尤其是灵敏度，高度依赖于所使用的光敏材料。金属配合物，如钌和铱（Ir）配合物，是PEC传感中的关键光敏材料，并且常被用作光敏插层剂用于信号检测。与钌配合物相比，Ir配合物具有更高的稳定性、更长的激发态寿命、更好的电荷转移能力和更丰富的激发态，因此其光电转换效率更高。这些特性使得Ir配合物在各种PEC应用中展现出极大的潜力。例如，Luo等人开发了一种用于miRNA-122b检测的PEC平台，使用了含香豆素6的环金属铱配合物，实现了低至0.23飞摩尔（fM）的检测限。更近期，Tang等人使用了Ir配合物[(ppy)?Ir(dppz)]?PF??作为光活性材料，并结合杂交链反应放大策略，开发了一种用于DNA检测的高灵敏度PEC生物传感器，实现了低至9.0飞摩尔的检测限。

dCas13a系统是一种基于Cas13a核糖核酸酶的RNA靶向工具。它由失活的Cas13a蛋白（dCas13a）和特定的引导RNA（crRNA）组成。由于在高等真核生物和原核生物核苷酸结合域的催化残基中存在失活突变，dCas13a蛋白缺乏cis-和trans-切割核酸酶活性。通过crRNA的引导，dCas13a能够精准识别和结合目标RNA序列，使其成为多种应用中的多功能工具。例如，通过将dCas13与荧光蛋白或其他标记物融合，可以在细胞内实时确定特定RNA分子的位置和动态变化。此外，通过将dCas13与翻译起始或抑制因子结合，可以在不改变基因序列的情况下增强或抑制特定蛋白的表达。进一步地，将dCas13与其他RNA编辑酶，如腺苷脱氨酶和甲基转移酶样蛋白结合，可以实现特定位点的RNA编辑。综上所述，dCas13系统为RNA层面的操控和研究提供了一个强大且灵活的平台，在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用潜力。此外，由于dCas13缺乏trans-切割活性，它在多通道RNA检测中的应用潜力也尤为突出。因此，基于dCas13a系统和Ir配合物的多通道、高灵敏度、高特异性PEC检测策略在miRNA检测中展现出极大的应用可行性。然而，该策略仍然面临严重的挑战。主要问题在于miRNA序列长度较短，导致其与crRNA杂交形成双链核酸结构时，提供的Ir配合物附着位点不足。此外，Ir配合物本身具有较高的载流子复合率，这限制了其光电转换效率的提升。

在本研究中，我们开发了一种基于dCas13a系统和Ir配合物的链式精准放大（CPA）PEC生物传感器，用于同时检测多种miRNA。在“链式精准放大”这一术语中，“链”指的是由miRNA-crRNA双链和miRNA 3'端双链DNA组成的长双链核酸链；“精准”指的是通过dCas13a-crRNA复合物对目标miRNA的精准识别；“放大”指的是将识别信息转化为由多个纳米复合物附着于长双链核酸链所产生的显著光电流信号。该生物传感器被用于检测在非小细胞肺癌（NSCLC）中异常表达的miRNA-21和miRNA-29a/b/c。该传感器采用多通道丝网印刷电极（SPEs）构建，其中四个工作电极的基底为羧基化的垂直石墨烯。每个电极基底均被独立修饰为针对相应miRNA的dCas13a-crRNA复合物。此外，Ir配合物[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?和金纳米颗粒（NPs）被修饰在MoS?量子点（QDs）表面，以构建[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?@Au-dsDNA@MoS?纳米复合物，用于光电转换。在检测前，miRNA的3'端被连接至DNA连接子，同时设计单链（ss）DNA1和ssDNA2以形成双链DNA3。在目标miRNA存在的情况下，相应的dCas13a-crRNA复合物捕获miRNA，形成dCas13a-crRNA-miRNA-DNA连接子复合物。随后，双链DNA3连接至DNA连接子。接下来，[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?@ssDNA4@MoS?纳米复合物和Au-ssDNA5探针依次被修饰在电极上，并以[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?@Au-dsDNA@MoS?的形式锚定至crRNA-miRNA双链和双链DNA。由于多个纳米复合物可以结合到一条双链核酸上，目标miRNA的识别被转化为有价值的光电流响应信号。这种多通道链式精准放大生物传感器代表了一种高度有前景和创新性的方法，能够以高特异性和高灵敏度同时检测多种miRNA，具有在临床诊断中的显著应用价值。

为了阐明所构建传感器的光电化学反应机制，我们使用VASP软件进行了基于密度泛函理论的第一性原理计算。图1A展示了[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?的原子结构，图中左下角的插图显示了坐标系统。图1B展示了不同方向下的计算吸收光谱。[Ir(ppy)?(phen-NH?)]?在z方向显示出一个约450纳米的吸收峰，与预期结果高度一致。通过这些计算，我们进一步分析了Ir配合物在量子点表面的能级匹配情况及其对载流子复合的抑制效果。结果表明，通过合理设计量子点的能级结构，能够有效减少载流子的复合速率，从而提升光电转换效率。此外，金纳米颗粒的引入不仅增强了光电流的响应强度，还为纳米复合物的稳定性和功能性提供了重要支持。这种结合了多种纳米材料的复合结构，使得传感器在复杂样本中的检测性能更加优异，能够有效区分不同miRNA之间的微小差异。

在实际应用中，该生物传感器展现出卓越的性能。通过多通道设计，传感器能够同时检测多种miRNA，显著提高了检测效率。同时，通过链式精准放大机制，传感器能够将微弱的识别信号转化为显著的光电流响应，使得检测限达到亚摩尔级别。这种高灵敏度和高特异性使得该传感器在临床诊断中具有重要的应用价值。在临床样本测试中，传感器能够准确识别miRNA-21和miRNA-29a/b/c，显示出良好的重复性和稳定性。此外，传感器在不同浓度下的响应曲线表明，其具有良好的线性范围和动态检测能力，能够满足实际检测需求。这些结果表明，该生物传感器在疾病诊断和治疗监测方面具有广阔的应用前景。

此外，该研究还探讨了传感器在不同环境条件下的稳定性。实验结果表明，传感器在室温下能够保持较长的检测时间，且在不同pH值和离子强度的条件下仍能维持较高的检测性能。这种环境适应性使得该传感器在实际临床应用中更加可靠。同时，传感器的检测过程受到多种因素的影响，包括miRNA的浓度、纳米复合物的修饰效率以及电极的表面特性。因此，为了确保传感器的稳定性和准确性，我们对这些因素进行了系统优化。通过调整纳米复合物的修饰密度和电极的表面处理方法，我们显著提高了传感器的信号强度和检测灵敏度。这些优化措施使得该生物传感器在复杂样本中的检测性能得到了进一步提升，为其实用性奠定了坚实基础。

在本研究中，我们不仅关注传感器的检测性能，还对其在实际应用中的可行性进行了深入探讨。通过临床样本测试，我们验证了该生物传感器在真实疾病诊断中的有效性。测试结果表明，该传感器能够准确识别多种miRNA，并且其检测限达到了亚摩尔级别，这使得其在临床环境中具有重要的应用价值。此外，该生物传感器的检测过程简单高效，能够在短时间内完成对多个miRNA的同步检测，这大大提高了检测效率。同时，传感器的检测成本相对较低，这使得其在大规模应用中更具经济优势。这些优势使得该生物传感器在临床诊断和疾病监测中具有广阔的应用前景。

在实际应用中，该生物传感器还展现出良好的可重复性和可扩展性。通过标准化的检测流程和优化的传感器结构，该生物传感器能够在不同实验条件下保持一致的检测性能。此外，该传感器的检测方法可以进一步拓展，以适应更多类型的miRNA检测需求。例如，通过调整crRNA的序列设计，可以扩展该传感器对不同miRNA的识别能力，从而实现更广泛的检测范围。同时，该传感器的结构设计也为其他生物分子的检测提供了借鉴，具有重要的研究价值。这些研究结果表明，该生物传感器不仅在miRNA检测方面具有突破性，还为其他生物分子的检测提供了新的思路和方法。

该研究还探讨了传感器在实际应用中的潜在挑战和解决方案。例如，在复杂样本中，miRNA的浓度可能受到多种因素的影响，包括样本的处理方法和存储条件。因此，为了确保检测结果的准确性，我们对样本的预处理方法进行了优化，以减少干扰因素对检测结果的影响。此外，传感器的检测过程需要严格控制实验条件，以确保检测信号的稳定性和可重复性。这些优化措施使得该生物传感器在实际应用中更加可靠和高效。通过这些研究，我们进一步验证了该生物传感器在临床诊断中的实用价值，并为其实现大规模应用提供了理论支持和实践指导。

综上所述，本研究成功开发了一种基于dCas13a系统和Ir配合物的多通道链式精准放大PEC生物传感器，用于miRNA的精准和同步检测。该生物传感器通过将miRNA的识别信息转化为显著的光电流响应，实现了高灵敏度和高特异性。其多通道设计和链式精准放大机制显著提高了检测效率和准确性，具有在临床诊断中的重要应用价值。此外，该研究还探讨了传感器在实际应用中的可行性，并验证了其在复杂样本中的检测性能。这些研究成果不仅为miRNA检测提供了新的方法，也为其他生物分子的检测提供了重要的借鉴和启示。