免疫健全小鼠黑色素瘤软脑膜转移模型的建立及鞘内PD-1阻断疗效评估

《Scientific Reports》：Preclinical models of melanoma leptomeningeal disease to assess intrathecal checkpoint blockade

　　本研究针对预后极差的黑色素瘤软脑膜疾病(LMD)，成功建立了多种免疫健全小鼠原位模型，通过优化细胞注射技术显著改善了肿瘤在中枢神经系统的分布模式。研究证实鞘内(IT)联合全身抗PD-1治疗可显著延长模型小鼠生存期并增强肿瘤内CD8+T细胞浸润，为临床开发LMD免疫治疗方案提供了关键临床前平台。

　　

软脑膜疾病(Leptomeningeal Disease, LMD)是晚期黑色素瘤患者面临的最严重并发症之一，肿瘤细胞播散至脑脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)和软脑膜，可导致一系列神经系统症状，患者中位总生存期仅约3.5个月。尽管免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitor, ICI)在黑色素瘤脑实质转移患者中显示出显著疗效，但LMD患者通常被排除在临床试验之外，导致该领域治疗选择极为有限，存在巨大的未满足临床需求。近年来，研究者开始探索鞘内(Intrathecal, IT)给予免疫治疗的新策略。例如，前期临床研究显示IT白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)可使部分患者获得长期生存，但其严重毒性（如100%患者发生颅内压增高）限制了应用。最近，一项IT联合静脉(Intravenous, IV)纳武利尤单抗（抗PD-1抗体）的I/Ib期试验初步结果表明该方案安全性良好，中位总生存期达7.5个月，提示IT ICI是一种有前景的治疗方向。然而，要深入理解其作用机制并优化疗效，亟需能够模拟临床LMD特征的免疫健全临床前模型。以往LMD模型研究多集中于免疫缺陷动物，难以用于评估免疫疗法。因此，开发可靠的免疫健全动物模型对于加速LMD新疗法的研发至关重要。本研究旨在建立并表征一系列免疫健全的原位小鼠LMD模型，并利用这些模型评估IT抗PD-1治疗的安全性与有效性。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

为开展此项研究，研究人员主要应用了几项关键技术。研究采用C57BL/6J免疫健全小鼠。通过小脑延髓池(Cisterna Magna)穿刺术进行鞘内注射，将荧光素酶标记的多种鼠源黑色素瘤细胞系（如B16-F10, BP, D4M, D4M-UV2, RMS, YUMM3.1等）植入小鼠蛛网膜下腔以建立LMD模型，并优化了细胞注射浓度和体积以更好地模拟临床病灶分布。利用活体生物发光成像(Bioluminescence Imaging, BLI)技术无创、动态地监测肿瘤的生长与分布。对处死小鼠的脑和脊髓组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色和免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)分析（标记物包括MART1、gp100、CD8），以病理学确认LMD并评估肿瘤免疫微环境。通过细胞增殖实验（结晶紫染色法）比较了不同细胞系的体外生长特性。最后，在荷瘤小鼠模型中评估了单次鞘内注射和/或多次腹腔注射抗PD-1抗体（同种型对照作为对照）的治疗效果，并以生存分析和肿瘤内CD8⁺T细胞浸润密度作为主要疗效指标。

建立B16-F10鼠黑色素瘤LMD模型

研究人员首先通过经皮鞘内注射技术将1.5x10⁴个B16-F10细胞（悬浮于10μL HBSS中）植入C57BL/6小鼠的小脑延髓池，成功建立了LMD模型。

术后3天，活体生物发光成像确认了肿瘤植入。尸检显示，B16-F10肿瘤沉积存在于脊髓和颅底蛛网膜下腔等部位。H&E染色和黑色素瘤标志物MART1的IHC染色从组织学上证实了软脑膜转移灶的存在。

其他细胞系LMD模型的表征

研究进一步测试了包括BP、D4M、D4M-UV2、RMS、YUMMER1.7和YUMM3.1在内的多种鼠源黑色素瘤细胞系，以及常用于免疫治疗研究的MC38-gp100结肠腺癌细胞系。

结果显示，各细胞系建模的围术期死亡率在10%-28.6%之间。术后3天BLI信号阳性率在75%-100%之间。各模型的中位总生存期存在差异，范围在13至48天。其中，B16-F10、BP和RMS模型有20%-60%的小鼠在注射部位远端脊髓形成了转移灶，表明肿瘤发生了弥漫性播散。体外增殖实验表明，细胞在体内的侵袭性与其体外增殖速率并非完全一致，提示某些细胞系可能对鞘内环境有特殊的适应性。

稀释细胞悬液鞘内注射改善LMD病灶分布

为了更贴近临床常见的弥漫性病灶分布，而非初始模型中常见的颅腔大块病灶，研究者优化了建模条件。他们发现，将注射细胞数减少至2.0x10³个，同时将悬浮体积增加至20μL（称为“稀释模型”），能有效促进肿瘤细胞在整个中枢神经系统的播散。

采用此优化条件后，部分细胞系的围术期死亡率降至0%，所有模型的中位总生存期延长至21-76天。更重要的是，B16-F10、BP和RMS模型的小鼠100%出现了远端脊髓转移灶，其分布模式更符合临床实际。

鞘内抗PD-1治疗初始LMD模型

在初步疗效评估中，研究人员在B16-F10 LMD模型（1.5x10⁴细胞，10μL）中测试了抗PD-1疗法。小鼠被随机分为四组：对照组（IT同型对照+IP同型对照）、单用IT抗PD-1组、单用IP抗PD-1组、联合治疗组（IT抗PD-1+IP抗PD-1）。

结果显示，与对照组相比，单用IT或IP抗PD-1显示出延长生存期的趋势，而联合治疗是唯一能显著改善生存的方案（风险比HR=0.269, p=0.023）。IHC分析显示，所有含抗PD-1的治疗组均显著增加了LMD病灶内的CD8⁺T细胞浸润。

鞘内抗PD-1在稀释LMD模型中的结果

在优化后的稀释模型（2.0x10³细胞，20μL）中，研究者使用了更高的IT抗PD-1剂量（39μg），并延长了IP给药的持续时间。

在B16-F10模型中，单用IT抗PD-1和联合治疗均能显著延长生存期（IT单药HR=0.265, p=0.005；联合治疗HR=0.168, p<0.001），并伴随肿瘤内CD8⁺T细胞的增加。在YUMM3.1模型中，单用IP抗PD-1和联合治疗均显示出显著的生存获益。再次证实抗PD-1治疗能增强肿瘤免疫应答。

本研究成功建立并优化了多种免疫健全小鼠黑色素瘤LMD模型，这些模型较好地模拟了临床疾病的病理特征和分布模式。研究表明，通过调整鞘内注射的细胞浓度和体积，可以显著改善肿瘤在中枢神经系统内的播散，尤其是增加脊髓远端转移灶的形成，从而更真实地反映LMD的临床情况。研究证实，鞘内给予抗PD-1抗体在非荷瘤小鼠中安全性良好，在荷瘤模型中，无论是单药还是与全身治疗联合，均能诱导抗肿瘤免疫应答（表现为CD8⁺T细胞浸润增加），并显著延长模型动物的生存期。尽管该模型存在诸如经皮注射有一定围术期风险、荧光素酶标记可能增加肿瘤免疫原性、以及直接鞘内注射绕过转移步骤等局限性，但它为在免疫健全环境下研究LMD的免疫治疗提供了一个宝贵、可重复且易于实施的平台。这些模型的建立，为未来评估更多鞘内免疫治疗策略（如其他检查点抑制剂、细胞因子等）奠定了坚实基础，将极大地推动针对黑色素瘤LMD这一顽疾的新疗法研发进程。