USP9X作为机械敏感去泛素化酶通过稳定YAP调控肿瘤细胞侵袭性与药物反应

《Cell Reports》：USP9X is a mechanosensitive deubiquitinase that controls tumor cell invasiveness and drug response through YAP stabilization

　　本研究聚焦于细胞外基质（ECM）刚度如何通过去泛素化酶（DUBs）调控肿瘤机械生物学行为这一前沿问题。研究人员发现胶原 stiffness 可特异性激活去泛素化酶USP9X，并通过DDR/actomyosin通路稳定机械感受器YAP蛋白水平。靶向USP9X可显著抑制黑色素瘤细胞的机械感知、侵袭能力和耐药性，揭示USP9X作为新型机械敏感治疗靶点的重要价值。

　　

在肿瘤微环境中，细胞外基质（ECM）的异常硬化是恶性肿瘤的典型特征之一。这种机械性微环境变化通过激活细胞内机械信号转导通路，促进肿瘤细胞的侵袭、转移和治疗抵抗。其中，Hippo通路效应因子YAP（Yes-associated protein）及其同源物TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding domain）作为关键的机械感受器，将细胞外机械信号转化为细胞内转录应答，在肿瘤进展中发挥核心作用。然而，细胞如何感知ECM刚度变化并精确调控YAP/TAZ蛋白稳定性的分子机制尚不完全清楚。

与此同时，泛素-蛋白酶体系统（UPS）作为细胞内蛋白质稳态的主要调控机制，在肿瘤发生发展中扮演重要角色。去泛素化酶（DUBs）能够逆转蛋白质的泛素化修饰，防止其被蛋白酶体降解，从而稳定多种促癌蛋白的表达。尽管有研究表明某些DUBs参与肿瘤进程，但它们是否以及如何响应机械信号并调控机械转导通路，特别是在黑色素瘤这一高度恶性且易耐药的肿瘤类型中，仍是一个未被探索的领域。

黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤癌，其高死亡率主要归因于早期转移和治疗抵抗。超过75%的黑色素瘤存在BRAF、NRAS或NF1基因突变，导致MAPK通路持续激活。虽然BRAF和MEK靶向药物及免疫疗法改善了转移性黑色素瘤患者的生存，但多数患者最终会产生耐药性。近年研究发现，ECM重塑和肿瘤硬化通过YAP依赖性机制促进靶向治疗抵抗，形成一种机械性前馈循环。然而，这一过程中DUBs的具体作用机制仍有待阐明。

针对这一科学问题，法国尼斯大学Marcel Deckert团队在《Cell Reports》上发表了最新研究成果。研究人员通过将黑色素瘤细胞培养在不同硬度的胶原基质上，结合活性泛素探针分析和定量蛋白质组学技术，系统研究了机械信号对DUBs活性的调控作用。

研究采用的主要技术方法包括：使用不同刚度胶原基质模拟肿瘤机械微环境；应用HA标记的泛素乙烯基砜（HA-Ub-VS）探针进行DUBs活性分析；通过siRNA和shRNA进行基因敲低；利用小分子抑制剂进行药理学干预；采用蛋白质印迹、免疫荧光和实时定量PCR分析蛋白表达和定位；通过GST-TUBEs（tandem ubiquitin binding entities）技术分析蛋白质泛素化状态；建立小鼠移植瘤模型进行体内功能验证；并利用公共数据库（TCGA）进行临床相关性分析。

ECM刚度通过DDR/肌动球蛋白通路调控USP9X活性

研究人员首先发现，胶原基质刚度能够显著影响黑色素瘤细胞中DUBs的全局活性模式。通过活性泛素探针结合定量蛋白质组学分析，他们鉴定出多个受刚度调控的DUBs，其中USP9X（ubiquitin specific peptidase 9 X-linked）在硬胶原基质上活性显著增强。这种刚度依赖的USP9X激活需要肌球蛋白II活性和DDR（discoidin domain receptor）胶原受体的参与，表明机械信号通过DDR/肌动球蛋白通路特异性调控USP9X的活性。

USP9X与YAP存在物理和功能相互作用

生物信息学分析预测YAP是USP9X的潜在相互作用蛋白，实验证实两者在黑色素瘤细胞中存在物理结合。重要的是，YAP蛋白水平随ECM刚度增加而升高，且USP9X表达与YAP转录特征在黑色素瘤患者中显著正相关。临床数据分析进一步显示，USP9X和YAP高表达均与黑色素瘤患者不良预后相关，提示USP9X-YAP轴在肿瘤进展中的临床意义。

USP9X调控YAP蛋白水平和活性

基因敲低或药理学抑制USP9X可显著降低YAP蛋白表达，但不影响其mRNA水平，表明USP9X在翻译后水平稳定YAP。USP9X抑制还减少YAP核定位及其靶基因表达。这种调控具有特异性，因为USP9X敲低不影响YAP同源物TAZ的表达。值得注意的是，USP9X对YAP的调控在不同黑色素瘤细胞系和多种实体瘤细胞（如肺癌、乳腺癌、胰腺癌细胞）中均存在，表明这一机制具有普适性。

USP9X调控YAP的泛素化和降解

机制研究表明，USP9X通过其去泛素化酶活性阻止YAP的蛋白酶体降解。过表达野生型USP9X可增加YAP蛋白水平，而催化失活突变体（C1566A）无此效应。蛋白酶体抑制剂处理可增加YAP表达，而联合蛋白合成抑制剂和USP9X抑制剂可完全消除YAP蛋白。GST-TUBEs下拉实验证实USP9X抑制可增强YAP的多聚泛素化水平。此外，蛋白酶体抵抗型YAP突变体（YAP5SA）的表达不受USP9X敲低影响，进一步证明USP9X通过调控YAP泛素化降解来维持其稳定性。

USP9X促进黑色素瘤细胞迁移和侵袭

功能实验显示，USP9X敲低或抑制可显著 impair 黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和胶原收缩能力。稳定敲低USP9X的细胞在硬胶原上的运动性降至与软胶原上对照细胞相当的水平，表明USP9X是细胞机械感知的关键介质。在体内实验中，USP9X敲低显著抑制黑色素瘤细胞的肺转移能力。重要的是，表达蛋白酶体抵抗型YAP突变体可挽救USP9X敲低导致的细胞运动缺陷，证明USP9X的功能依赖其对YAP稳定性的调控。

靶向USP9X阻止治疗诱导的YAP上调和黑色素瘤机械重编程

在治疗背景下，USP9X抑制可增强BRAF/MEK靶向药物的疗效。联合治疗显著延缓小鼠模型中肿瘤的复发，并抑制治疗诱导的ECM重塑和YAP信号激活。免疫组化分析显示，联合治疗可有效阻断单药治疗引发的胶原网络重构和YAP积累。这些结果表明，靶向USP9X可破坏YAP依赖的机械适应性耐药机制。

本研究系统阐明了USP9X作为机械敏感去泛素化酶在肿瘤机械生物学中的核心作用。研究人员发现ECM刚度通过DDR/肌动球蛋白通路激活USP9X，进而通过去泛素化稳定YAP蛋白，促进肿瘤细胞的侵袭性和治疗抵抗。这一机械信号转导通路在多种实体瘤中保守存在，提示USP9X-YAP轴可能是广泛的机械适应性反应的共同机制。

研究的创新点在于首次将DUBs与机械信号转导直接联系，揭示了蛋白质稳定性调控在细胞机械感知中的重要作用。从转化医学角度，USP9X作为"机械-DUB"的概念为其作为治疗靶点提供了理论依据。特别是在靶向治疗耐药的背景下，USP9X抑制剂与现有疗法的联合使用可能克服由机械微环境介导的耐药问题。

然而，研究也存在一定局限性，如尚未在更生理性的3D ECM模型中验证USP9X的机械调控，也未阐明刚度增强USP9X活性的精确分子机制。此外，USP9X除YAP外可能还有其他重要底物参与机械应答，这些都有待未来研究深入探索。

总体而言，这项研究不仅深化了我们对肿瘤机械生物学的理解，也为克服治疗抵抗提供了新的策略思路。针对USP9X-YAP轴的干预可能成为改善黑色素瘤及其他实体瘤治疗效果的新途径，具有重要的临床转化价值。