LEUTX与OTX2协同调控猪扩展多能干细胞(pEPSCs)全能性向多能性转变及异质性机制研究

《Cell Reports》：LEUTX and OTX2 orchestrate totipotency-to-pluripotency transitions and heterogeneity in pEPSCs

　　本刊推荐：针对扩展多能干细胞(EPSCs)发育潜能存在争议的问题，研究人员通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术揭示猪EPSCs(pEPSCs)存在从全能性到始动多能性的转录异质性。研究发现OTX2通过调控谱系基因表达驱动pEPSCs异质性形成，而LEUTX过表达可激活全能性基因并促进类胚泡形成。该研究为哺乳动物早期胚胎发育调控机制提供了新见解，对农业和生物医学领域具有重要应用价值。

　　

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，受精卵经过一系列精确调控的细胞分裂和分化，最终形成具有三种胚层的囊胚。这一过程涉及从全能性（能发育成胚胎和胚外组织）到多能性（仅能发育成胚胎组织）的关键转变。尽管科学家已能在体外培养多种多能干细胞，但如何捕获和维持真正意义上的全能干细胞仍是再生医学领域的重大挑战。

扩展多能干细胞(EPSCs)因其独特的双向发育潜能（既能分化为胚胎组织又能分化为胚外组织）而备受关注。然而，不同物种EPSCs的分子特征存在显著差异：人EPSCs(hEPSCs)类似于8细胞期至桑葚胚阶段，而小鼠EPSCs(mEPSCs)更接近植入后外胚层。这种物种特异性差异使得猪EPSCs(pEPSCs)成为研究哺乳动物早期发育的理想模型，不仅因为猪在生理和器官大小上与人类更为接近，更因其在农业育种和异种移植等领域具有重要应用价值。

发表在《Cell Reports》上的这项研究，通过整合单细胞转录组测序、染色质可及性分析和功能验证实验，系统揭示了pEPSCs中存在的发育状态异质性，并发现了OTX2和LEUTX在这一过程中的关键调控作用。研究人员首先通过单细胞转录组测序技术分析了384个pEPSCs，经过质控后获得341个细胞的转录组数据。同时，研究人员建立了NANOG-tdTomato/SOX2-EGFP双荧光报告系统，通过流式细胞分选技术分离不同亚群。此外，还利用ATAC-seq分析染色质开放性，ChIP-seq检测转录因子结合位点，并通过体外转录和显微注射技术进行功能验证。

pEPSCs呈现从全能性到始动多能性的转录异质性

研究人员通过单细胞转录组分析发现pEPSCs中存在三个明显不同的亚群：C1（高NANOG、低SOX2）表现出全能性特征，表达SYT6、ADGRV1等全能性基因；C3（低NANOG、高SOX2）呈现始动多能性状态，高表达ETV4、NODAL等基因；而C2则处于中间过渡状态。这一发现表明pEPSCs实际上捕获了从桑葚胚到植入后外胚层的连续发育阶段。

分离和鉴定pEPSCs中的多能性亚群

通过双荧光报告系统，研究人员成功分离出C1、C2和C3三个亚群。转录组分析显示，FACS_C1细胞中氧化磷酸化相关基因表达上调，而FACS_C3细胞中糖酵解途径基因更为活跃，这与幼稚多能性和始动多能性细胞的代谢特征一致。值得注意的是，当将分离的亚群重新培养时，它们都能恢复到原始pEPSCs的状态，表明这些状态之间的转变是可逆的。

鉴定参与全能性向多能性转变的关键调控因子

通过整合胚胎发育过程中的染色质可及性数据，研究人员发现了一个保守的5'-TAATCC-3'基序，该基序在全能性向多能性转变过程中发挥重要调控作用。进一步分析确定了四个促全能性转录因子：ARGFX、DPRX、DUXA和LEUTX，它们均在4细胞期至桑葚胚阶段高表达，而在植入后外胚层中表达量极低。

LEUTX过表达促进全能性并实现自发类胚泡形成

功能实验表明，LEUTX过表达能诱导pEPSCs形成穹隆状集落，提高NANOG相对于SOX2的表达水平，显著增加全能性样的FACS_C1亚群比例。更重要的是，LEUTX过表达的pEPSCs在类胚泡培养条件下能自发形成具有囊腔的类胚泡结构，这些结构包含SOX2阳性的上胚层样细胞、GATA3阳性的滋养层样细胞和GATA6阳性的下胚层样细胞，成功模拟了天然囊胚的三个奠基细胞谱系。

LEUTX激活pEPSCs中的全能性基因

分子机制研究表明，LEUTX通过直接结合到全能性相关基因的启动子区域，识别5'-TAATCC-3'基序，从而增强染色质可及性并激活基因表达。这导致pEPSCs的转录组特征从囊胚样状态向4细胞样状态转变，表明LEUTX在促进全能性方面发挥关键作用。

LEUTX通过抑制OTX2促进多能性网络的解离

研究发现，LEUTX过表达会显著抑制OTX2的表达，而OTX2在维持始动多能性中起关键作用。OTX2敲除导致pEPSCs形态扁平化，多能性基因表达下调，而OTX2过表达则能逆转LEUTX诱导的全能性表型。这表明LEUTX通过抑制OTX2来促进多能性网络的解离，从而为全能性基因的表达创造有利条件。

LEUTX介导的全能性基因激活依赖于OTX2抑制

进一步实验证实，在LEUTX过表达的pEPSCs中同时过表达OTX2，会消除穹隆状形态并抑制全能性基因的表达。在猪受精卵中过表达OTX2也会阻碍胚胎基因组激活(EGA)，导致4细胞期发育停滞。这些结果共同表明OTX2抑制是LEUTX激活全能性基因的必要条件。

本研究系统揭示了pEPSCs的转录异质性特征，发现其同时具备桑葚胚和植入后外胚层的分子特征。研究人员不仅鉴定出OTX2和LEUTX作为调控全能性向多能性转变的关键因子，还阐明了它们之间的拮抗作用机制：OTX2通过激活多能性和谱系特异性基因促进始动多能性状态，而LEUTX通过抑制OTX2和直接激活全能性基因来增强全能性。

这些发现对干细胞生物学和发育生物学领域具有重要意义。首先，研究建立的pEPSCs模型为研究哺乳动物早期胚胎发育提供了重要工具，特别是在大型动物模型中研究细胞命运决定的分子机制。其次，发现OTX2和LEUTX的调控关系为理解多能性退出和全能性获得提供了新视角，这对提高体细胞重编程效率和干细胞定向分化能力具有指导价值。此外，LEUTX过表达诱导的类胚泡形成能力为研究早期胚胎发育和组织自组装提供了新模型，有望推动器官再生和疾病建模研究。

然而，研究也存在一定局限性，如LEUTX在野生型pEPSCs中不表达，其过表达诱导的全能性状态的生理相关性仍需进一步验证。未来研究需要探索内源性调控pEPSCs全能性的因子，并优化培养条件以更好地模拟体内胚胎发育环境。

总体而言，这项研究不仅深化了我们对哺乳动物早期发育调控网络的理解，也为农业动物育种和再生医学应用提供了新的理论基础和技术平台。通过揭示物种特异性多能性调控机制，研究为跨物种发育生物学比较研究提供了重要参考，对推动生物医学领域的发展具有深远影响。