单细胞与空间转录组揭示肝母细胞瘤化疗后免疫微环境重塑及肿瘤-成纤维细胞互作新机制

《Cell Reports Medicine》：Single-cell profiles delineate immune cell remodeling and enhanced tumor-fibroblast interaction of hepatoblastoma after chemotherapy

　　本研究针对肝母细胞瘤(HB)化疗耐药机制不清的问题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组学(ST)技术，对32例患者化疗前后的肿瘤微环境(TME)进行系统分析。研究发现化疗后CD69+CD8+T细胞浸润增加，髓系细胞向免疫激活表型重塑，同时鉴定出高表达FGFR4的增殖性肝样细胞(HECs)通过FGF-FGFR4信号通路与MMP11+癌症相关成纤维细胞(CAFs)互作促进化疗耐药。FGFR4抑制剂在患者来源异种移植(PDX)模型中显著抑制肿瘤生长，为HB靶向治疗提供了新策略。

　　

在儿童恶性肿瘤中，肝母细胞瘤(HB)是最常见的肝脏原发肿瘤，近年来发病率呈现显著上升趋势。这种胚胎性肿瘤被认为起源于肝前体细胞——肝母细胞，其组织学特征表现为胎儿型、胚胎型和间质型等多种亚型共存的特点。虽然手术联合化疗显著改善了HB患者的预后，但临床晚期患者的3年无事件生存率仍仅有34%，化疗耐药成为治疗失败的主要原因。

传统基因组学和转录组学研究虽然揭示了HB的关键驱动基因CTNNB1突变，并尝试靶向Myc信号、FABRCA信号等多个通路，但由于对HB肿瘤细胞分子特征及化疗响应机制理解不足，靶向治疗进展缓慢。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的出现为深入解析肿瘤细胞异质性、TME组成及治疗响应提供了全新视角。

在这项发表于《Cell Reports Medicine》的研究中，陈德谦等人整合scRNA-seq、空间转录组学、批量转录组学等多组学技术，对32例HB患者化疗前后的肿瘤样本进行系统分析，构建了迄今为止最全面的HB单细胞图谱。研究人员通过10x Genomics平台对37个肿瘤样本进行测序，获得368,116个高质量细胞，建立了包括上皮细胞(69%)、免疫细胞(14%)和基质细胞(10%)在内的HB TME单细胞图谱。

研究发现化疗后上皮细胞比例下降1.5倍，而T细胞比例增加2.4倍，表明化疗在杀伤肿瘤细胞的同时促进了免疫细胞浸润。特别值得关注的是，CD69⁺CD8⁺T细胞在化疗后显著富集，这类细胞表达组织驻留标志物CD69，同时高表达CXCR4、CXCR6等T细胞招募标记以及IFNG、GZMK等效应分子，表现出强大的抗肿瘤活性。通过荧光激活细胞分选(FACS)分离CD69⁺CD8⁺T细胞并与GFP标记的HepG2细胞共培养，证实该亚群具有最强的肿瘤细胞杀伤能力。

髓系细胞分析揭示了化疗诱导的免疫激活表型重塑。Macro_C1QC等M2样表型巨噬细胞比例下降，而cDC3等经典树突状细胞亚群比例上升。细胞互作分析显示，化疗后髓系细胞通过CD80-CD28、CD58-CD2等共刺激通路增强与CD69⁺CD8⁺T细胞的相互作用，空间转录组学进一步证实了cDC3与CD69⁺CD8⁺T细胞的空间共定位。

肿瘤细胞异质性分析鉴定出肝样细胞(HECs)和间质样细胞(MECs)两大亚群。HECs表达AFP、GPC3等肝祖细胞标志，而MECs高表达VIM等间质标志。值得注意的是，增殖性肿瘤细胞主要集中于HECs亚群(18.0%)，而MECs中增殖细胞比例仅为6.5%。化疗后，尽管总体肿瘤负荷下降，但HECs相对比例反而上升，MECs则显著下降，提示HECs具有更强的化疗耐药性。

机制研究发现，化疗后HECs显著上调细胞解毒通路相关基因表达，而基线HECs的解毒基因表达水平也高于MECs。体外实验中， cisplatin处理的HepG2细胞中SOD1、PRDX3等解毒基因表达显著上调，敲低这些基因可增强化疗敏感性。

通过NicheNet算法构建的细胞互作网络揭示了FGF-FGFR信号通路与肿瘤细胞增殖的密切关联。FGFR4特异性表达于HECs，而FGFR1主要表达于MECs。生存分析显示FGFR4高表达与患者不良预后显著相关，而FGFR1无此关联。

基质细胞分析发现MMP11⁺CAFs亚群高表达FGF3、FGF8等配体，与HECs的FGF-FGFR4信号互作在化疗后显著增强。空间转录组学证实MMP11⁺CAFs与AFP⁺MKI67⁺肿瘤细胞空间相邻，且FGF3-FGFR4、FGF9-FGFR4配体-受体对互作显著。

PDX模型验证显示，FGFR4抑制剂roblitinib显著抑制肿瘤生长，减少AFP⁺KI67⁺增殖肿瘤细胞数量。虽然单药疗效未超越化疗，但在低剂量化疗条件下与vincristine联用表现出协同效应。而在FGFR4阴性肿瘤中，roblitinib无明显疗效，证实其作用特异性。

本研究的主要技术方法包括：对32例HB患者的37个肿瘤样本进行10x Genomics单细胞RNA测序；利用空间转录组学分析肿瘤组织原位细胞分布；通过多重免疫荧光(mIHC)验证关键发现；建立患者来源异种移植(PDX)模型进行药物验证；采用NicheNet、CellPhoneDB等算法解析细胞间通信。

单个细胞图谱揭示HB化疗后免疫微环境特征

研究通过对37个肿瘤样本的scRNA-seq分析，构建了HB TME的单细胞图谱，发现化疗后上皮细胞比例下降，T细胞等免疫细胞浸润增加。这一发现通过病理评估验证，证实单细胞数据能准确反映组织水平肿瘤负荷。

CD69⁺CD8⁺T细胞富集与功能激活

T细胞亚群分析发现CD69⁺CD8⁺T细胞在化疗后显著增加，这类细胞具有组织驻留特征，表达效应分子但缺乏耗竭标志。功能实验证实其强大的肿瘤细胞杀伤能力，RNA速度分析显示其向耗竭T细胞分化的轨迹。

髓系细胞向免疫激活表型重塑

髓系细胞分析显示化疗后Macro_C1QC等M2样巨噬细胞减少，cDC3等树突状细胞增加。细胞互作分析发现髓系细胞通过共刺激通路增强T细胞激活，空间转录组证实其空间共定位。

肿瘤细胞异质性鉴定与化疗耐药关联

肿瘤上皮细胞分群鉴定出HECs和MECs两大亚群，HECs具有更强增殖活性和化疗耐药性。临床关联分析发现增殖性HECs与治疗耐药和不良预后相关，而分化型HECs与治疗响应相关。

FGF-FGFR4信号通路介导化疗耐药

细胞通信分析发现FGF-FGFR信号与肿瘤增殖密切相关，其中FGFR4特异性表达于HECs。生存分析证实FGFR4高表达与预后不良相关，提示其作为治疗靶点的潜力。

基质细胞与肿瘤细胞互作促进耐药

基质细胞分群发现MMP11⁺CAFs亚群高表达FGF配体，与HECs的FGF-FGFR4信号在化疗后增强。空间分析证实两者的紧密空间关联和特异性互作。

FGFR4靶向治疗验证

PDX模型证实FGFR4抑制剂有效抑制肿瘤生长，联合化疗在低剂量条件下显示协同效应。在FGFR4阴性肿瘤中无疗效，证实治疗特异性。

本研究通过多组学整合分析，系统揭示了HB化疗后TME的重塑特征，特别是免疫细胞激活和肿瘤-基质互作在化疗耐药中的关键作用。发现FGFR4作为HECs特异性靶点，其抑制剂在临床前模型中显示良好疗效，为HB精准治疗提供了新方向。研究还提示联合免疫治疗可能进一步增强疗效，为改善高危HB患者预后提供了新思路。

研究的局限性在于配对样本数量有限，未来需要更大队列验证TME异质性与临床结局的关联。尽管FGFR4抑制剂显示疗效，但与化疗的联合策略仍需优化。这些发现为理解HB化疗耐药机制和开发联合治疗策略提供了重要理论基础和实验依据。