经磺鎓基团稳定的阿诺普林环肽具有增强的正电荷特性，从而展现出优异的抗菌活性、稳定性以及生物相容性

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Sulfonium-stabilized anoplin cyclic peptides with enhanced electro-positivity for effective antimicrobial activity, stability, and biocompatibility

　　硫鎓盐稳定化环闭交联策略有效提升了天然抗菌肽Anoplin的稳定性、抗菌活性与生物相容性，实验证实其可加速小鼠伤口愈合并降低细菌载量。

　　

李文军|陈俊龙|刘云燕|陈启志|李彦金|林莉芳洲|冯思思|陈向贵

四川大学西华学院食品与生物工程学院，四川省食品微生物学重点实验室，中国成都611130

摘要

抗生素的过度使用凸显了抗菌肽（AMPs）作为对抗病原菌的关键物质的重要性。然而，像anoplin这样的天然AMPs存在显著局限性，包括不稳定性和抗菌效果不佳。尽管先前的研究已经证明了稳定二级结构在增强抗菌活性中的关键作用，但人们对于RCM连接策略引入的疏水侧链所导致的溶血毒性增加表示担忧。为了解决这一挑战，我们提出了一种磺onium稳定的环化策略，通过共价环化稳定肽的结构，并通过基于硫的正电荷增强阳离子电荷密度。值得注意的是，这种改进的阳离子电荷有助于提高肽的抗菌活性，同时避免溶血毒性的增强。实验验证表明，磺onium稳定的anoplin环肽（AP[5,9]-Ph）表现出强效的抗菌活性、延长的蛋白酶稳定性以及保持的生物相容性。小鼠伤口感染模型显示，处理组的愈合速度加快，细菌负荷减少。这些发现表明，磺onium稳定的anoplin环肽是新型抗菌剂的有希望的候选者。此外，磺onium稳定的连接策略为优化像anoplin这样的天然抗菌肽的生物活性提供了强有力的方法，推动了新型抗菌剂的发展。

引言

随着全球对抗生素过度使用的关注日益增加，抗菌肽（AMPs）已成为对抗多重耐药病原体的有希望的解决方案。^1,2然而，像anoplin（NH₂-GLLKRIKTLL）这样的天然短AMPs面临重大挑战，包括稳定性差和抗菌效果有限，这严重阻碍了它们的实际应用。^3,4因此，在保持低溶血毒性的同时增强anoplin的稳定性和抗菌效果是其作为治疗剂开发中的关键挑战。更重要的是，这些挑战也代表了其他天然AMPs的重要研究空白。尽管已经研究了传统的修饰方法，如氨基酸替换和N端 conjugation，⁵, ⁶, ⁷但这些方法存在固有的局限性。具体挑战包括替换策略中的蛋白酶敏感性⁵、N端修饰引起的溶血效应⁶，以及二聚化或组合修饰技术的复杂合成要求⁷。这些未解决的问题凸显了在基于肽的抗菌剂开发中迫切需要创新的工程策略。

对Anoplin抗菌结构的机制研究表明，其α-螺旋构象对于抗菌活性至关重要。晶体学数据表明，在模拟膜条件的情况下（DPC胶束），Leu²-Leu¹⁰残基采用一种穿透胶束核心的α-螺旋结构，深度在14至23 ?之间，这种配置与破坏膜的能力相关。^8,9这些发现表明，稳定Anoplin的二级结构是提高分子稳定性和抗菌性能的可行策略。这些见解为克服肽工程中的当前障碍提供了指导原则。

2021年，Wojciechowska等人¹⁰和Wu等人¹¹利用环闭合置换（RCM）技术设计了稳定的Anoplin环状类似物。他们的研究表明，RCM连接增强了肽的二级结构，同时提高了抗菌效力和抗酶降解能力。然而，用于连接的疏水侧链无意中增加了溶血活性，从而降低了治疗效果。这些局限性突显了抗菌肽（AMP）开发中未解决的挑战，并强调了需要平衡结构完整性和低溶血毒性的稳定策略。

从AMP设计的角度来看，阳离子电荷和疏水性是抗菌肽（AMP）效力的关键决定因素，影响抗菌活性和生物相容性。^12,13增加阳离子电荷可以增强与细菌膜的静电相互作用，提高膜破坏效率。¹³此外，正电荷可以提高亲水性，有效抵消侧链环化引起的过度疏水性，防止溶血毒性的增加。因此，在天然AMPs（如anoplin）中实现稳定稳定并显著增强其正电荷以避免溶血毒性仍然是一个艰巨的挑战，目前尚未有有前景的研究方向进行探索。

Shi及其同事在肽工程方面的最新进展揭示了一种创新的环化技术，该技术可以同时稳定二级结构并增强正电荷密度。这种方法可以通过侧链环化引入两个磺onium中心，从而提供大量的正电荷。¹⁴, ¹⁵, ¹⁶受这些发现的启发，我们提出将这种基于磺onium的环化策略应用于优化像anoplin这样的天然抗菌肽（AMPs）。我们假设这种方法将增强活性二级结构并显著增加阳离子密度。这种双重益处有望提高其抗菌性能并减轻溶血毒性的增加，最终提高肽的稳定性、效力和生物相容性。此外，这种方法可能为其他天然抗菌肽的进一步开发提供有价值的框架。

材料

三氟乙酸（TFA）、吗啉、无水甲酸、三异丙基硅烷（TIS）、N,N-二异丙基乙胺、十二烷基硫酸钠（SDS）和异丙醇购自上海能源化工有限公司（中国上海）。醚、甲醇、二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙腈和二甲基亚砜（DMSO）购自成都科隆化工有限公司（中国四川）。利福平、多粘菌素B和环丙沙星（CIP）购自北京

物理化学性质的研究

为了验证我们的设计策略，我们合成了一系列磺onium稳定的环状anoplin衍生物（表S1），这些衍生物具有不同的环闭合位置（[2,6]、[3,7]、[4,8]、[5,9]）和磺onium基团（1,2-二溴甲基苯和1,4-二丁基）。这种系统性的变化受到两个关键因素的指导：有效靶向所需的α-螺旋构象（如Mourtada等人的开创性工作所示³¹）

结论

总之，我们采用了一种磺onium稳定的连接策略，通过硫基衍生化同时稳定了天然抗菌肽anoplin的二级结构，并增强了其阳离子性质。这种双重功能修饰显著提高了抗菌效力和稳定性，而没有增加溶血毒性。实验结果表明，磺onium稳定的环状anoplin表现出增强的抗菌活性

作者贡献声明

李文军：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源获取，项目管理，方法论，概念化。陈俊龙：项目管理，方法论，研究，正式分析，数据管理。刘云燕：方法论，研究。陈启志：研究，数据管理。李彦金：研究，数据管理。林莉芳洲：监督，资源获取。冯思思：监督，方法论。陈向贵：监督，方法论。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（22407113）、国家重点研发计划（2023YFF1104800）、四川省科技教育联合基金（2024NSFSC2062）和天府锦城实验室前沿医学中心基金（TFJC2023010008）提供的财政支持。