苯并[a]芘引起的线粒体依赖性铁死亡及异常导管反应的机制与针对性干预措施

《Free Radical Biology and Medicine》：Mechanisms and Targeted Intervention of Mitochondria-Dependent Ferroptosis and Abnormal Ductular Reaction Caused by Benzo(a)pyrene

　　本研究发现苯并[a]芘通过诱导肝小管上皮细胞铁死亡，激活14-3-3ε/VDAC1通路，导致ER-线粒体异常耦合和ROS过量，从而引发异常导管反应。中药单体槲皮素可有效靶向干预该通路，抑制铁死亡和DR进程。

　　慢性肝胆疾病（CHDs）是全球第二大疾病负担，其发生与进展与异常胆管反应（DR）密切相关。烟草吸烟作为CHDs的重要致病风险因素，然而其引发异常DR的具体功能和分子机制仍不明确。苯并[a]芘（B[a]P）是烟草中代表性肝胆毒性物质之一，本研究发现，B[a]P通过诱导胆管上皮细胞（BECs）发生铁死亡，从而驱动DR的出现。从分子机制来看，B[a]P的代谢激活产物——苯并[a]芘二醇单氧化物（BPDE）能够直接结合到14-3-3ε蛋白的Lys123位点，进而抑制其泛素化降解。14-3-3ε蛋白水平异常升高后，又通过磷酸丝氨酸结合/调控激活电压依赖性阴离子通道1（VDAC1），导致内质网（ER）与线粒体之间的异常耦合。这种异常的耦合缩短了ER与线粒体之间的距离，进而引发线粒体钙离子过载，最终导致活性氧（ROS）的过量产生。这些过程最终促使BECs发生铁死亡，并推动DR的发展。在靶向干预方面，我们进一步筛选并鉴定出一种传统中药单体——槲皮素，该化合物能够高效靶向14-3-3ε蛋白的磷酸丝氨酸结合区域。最终，我们证实通过槲皮素靶向干预14-3-3ε蛋白，可以显著抑制B[a]P诱导的铁死亡和异常DR。

慢性肝胆疾病涵盖了多种病理状态，如代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）、病毒性肝炎、胆管炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）和胆管癌（CCA），这些疾病对全球健康构成重大威胁，每年导致近200万人死亡。DR是许多CHDs中常见的修复反应，其病理特征与胆管发育相似，包括小叶间胆管增生、间质变化和炎症细胞浸润。根据组织形态学，DR可分为三种类型：典型增生、非典型增生和早期癌变胆管增生。DR在肝脏再生、修复、纤维化、肝硬化以及HCC和CCA的发展过程中发挥着重要作用。DR的启动机制在于，当肝脏受损时，受损的BECs会启动程序性细胞死亡，激活肝细胞（HPCs），并促使HPCs增殖和分化，从而导致反应性胆管细胞的显著增生。因此，BECs的程序性死亡在DR的启动过程中起着关键作用。

BECs程序性死亡的原因非常复杂，流行病学研究发现，除了遗传、免疫和病毒感染外，不健康的生活方式以及暴露于毒素是CHDs的主要诱因之一，其中长期吸烟、酗酒和高脂饮食是最具代表性的风险因素。目前，对由酒精或非酒精性脂肪肝引起的异常DR过程及其不良后果的研究已取得显著进展。然而，吸烟如何通过诱导BECs程序性死亡，进而引发异常DR过程和不良后果，其具体功能和机制仍不明确。烟草烟雾的组成复杂，其中已鉴定出超过60种致癌物，包括尼古丁、4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮（NNK）以及多环芳烃类化合物，如B[a]P，这些是烟草中最具危害性的成分。B[a]P由于其脂溶性和代谢特性，可以在体内持续积累。与尼古丁和NNK代谢在肝脏中发挥的解毒作用相比，B[a]P在肝脏中的代谢激活是其肝胆毒性的关键过程。更为重要的是，长期暴露于B[a]P会抑制谷胱甘肽S-转移酶A4的活性，从而导致其激活代谢产物——7,8-二羟基-9,10-环氧-B[a]P（BPDE）在胆道中的浓度增加，引发胆道细胞毒性。因此，B[a]P是烟草中代表性肝胆毒性物质。

鉴于BECs程序性死亡在DR启动中的核心作用，本研究旨在探讨B[a]P诱导的BECs程序性死亡的关键分子过程和核心靶点，并进一步揭示可能的高效靶向干预策略。本研究首先通过实验模型验证了B[a]P作为烟草致癌物中主要肝胆毒性物质的特性。实验中，雄性C57BL/6J小鼠被随机分为四组（NC、B[a]P、NNK和尼古丁），采用完全随机设计进行分组。经过两周的连续处理后，收集血清和肝组织进行分析。结果显示，在B[a]P、NNK和尼古丁组中，血清中的ALT、AST、ALP和GGT水平显著升高，相较于NC组，这些指标在B[a]P组中表现出最显著的增加。肝组织的病理学分析进一步证实了B[a]P对肝脏的损伤作用。

在研究过程中，我们发现B[a]P的代谢激活产物BPDE能够与E3泛素连接酶Parkin竞争性结合到14-3-3ε蛋白上，从而抑制14-3-3ε蛋白的泛素化降解，导致其蛋白水平异常升高。14-3-3ε蛋白的升高随后通过与VDAC1的结合，稳定VDAC1蛋白。稳定后的VDAC1触发了异常的ER-线粒体耦合，导致线粒体钙离子过载，进而引发ROS的过量生成。这一过程可能在诱导BECs发生铁死亡方面发挥关键作用。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物的积累和抗氧化系统功能的减弱。本研究进一步发现，通过槲皮素靶向干预14-3-3ε蛋白，能够有效抑制B[a]P诱导的铁死亡和异常DR。槲皮素作为一种天然存在的黄酮类化合物，具有良好的抗氧化和抗炎特性，在多种疾病中展现出潜在的治疗价值。

此外，本研究还探讨了B[a]P在不同病理状态下的作用机制。例如，在MAFLD、病毒性肝炎、胆管炎等疾病中，B[a]P的毒性作用可能通过不同的信号通路发挥作用。在某些情况下，B[a]P可能通过影响胆汁酸代谢，导致胆汁淤积和胆管损伤。而在其他情况下，B[a]P可能通过激活炎症反应，加剧肝脏的氧化应激状态，从而促进DR的发生。这种复杂的机制表明，B[a]P在不同疾病背景下的作用可能存在差异，需要进一步研究其在不同病理条件下的具体作用路径。

为了深入理解B[a]P的毒性机制，我们还对实验中使用的药物和试剂进行了详细说明。B[a]P（C20H12，纯度>96.0%）、二甲基亚砜（(CH3)2SO，纯度≥99.9%）、尼古丁（C10H14N2）和NNK（C10H13N3O2，纯度≥98.0%）均购自Sigma-Aldrich中国公司（上海，中国）。BPDE（C20H14O3）购自Santa Cruz中国公司（上海，中国）。玉米油和槲皮素（C15H10O7，纯度≥99.8%）购自MedChemExpress中国公司（上海，中国）。所有其他试剂均为分析级或最高可用等级。这些试剂的使用确保了实验的准确性和可重复性。

在研究过程中，我们还探讨了B[a]P对肝脏的急性损伤模型。建立一个能够诱导显著且明确的肝损伤模型，同时避免早期系统性急性毒性或慢性纤维化，是本研究的重要目标。通常，在B[a]P诱导的慢性肝病动物模型中，剂量范围为12.5 mg/kg至100 mg/kg。我们的前期研究表明，在该剂量范围内，B[a]P能够有效诱导肝脏的病理变化，同时保持较低的全身毒性。这一剂量范围为后续实验提供了重要的参考依据。

通过本研究，我们发现B[a]P的毒性作用主要通过影响BECs的代谢和功能实现。具体而言，B[a]P的代谢激活产物BPDE能够直接结合到14-3-3ε蛋白的Lys123位点，从而抑制其泛素化降解，导致其蛋白水平异常升高。这一现象在实验中得到了验证，表现为14-3-3ε蛋白的表达量显著增加。进一步研究发现，14-3-3ε蛋白的升高能够通过磷酸丝氨酸结合/调控激活VDAC1，导致ER与线粒体之间的异常耦合。这种异常的耦合缩短了两者的距离，进而引发线粒体钙离子过载，最终导致ROS的过量产生。这些过程共同作用，最终促使BECs发生铁死亡，并推动DR的发展。

在靶向干预方面，我们筛选并鉴定出槲皮素这一传统中药单体，该化合物能够高效靶向14-3-3ε蛋白的磷酸丝氨酸结合区域。这一发现为治疗由B[a]P引起的DR提供了新的思路。槲皮素作为一种天然的抗氧化剂，能够有效清除ROS，从而减轻氧化应激对细胞的损伤。此外，槲皮素还具有抗炎特性，能够抑制炎症因子的释放，从而减轻炎症反应对肝脏的损害。这些特性使得槲皮素成为一种潜在的治疗药物，能够在不引起显著副作用的情况下，有效干预由B[a]P引起的DR。

本研究还探讨了槲皮素在不同剂量下的作用效果。结果显示，随着槲皮素剂量的增加，其对B[a]P诱导的铁死亡和DR的抑制作用也逐渐增强。这一现象表明，槲皮素的干预效果可能与剂量相关。然而，过高的剂量可能会导致其他不良反应，因此需要在有效性和安全性之间找到平衡点。通过优化槲皮素的剂量，我们发现其在低剂量下即可有效抑制DR的进展，同时保持较低的毒性。这一发现为临床应用提供了重要的参考依据。

此外，本研究还探讨了槲皮素在不同病理状态下的作用机制。例如，在MAFLD和病毒性肝炎等疾病中，槲皮素可能通过不同的途径发挥作用。在MAFLD中，槲皮素可能通过改善脂肪代谢，减少脂肪堆积，从而减轻肝脏的损伤。而在病毒性肝炎中，槲皮素可能通过抑制病毒复制，减轻炎症反应，从而促进肝脏的修复。这些机制表明，槲皮素在不同疾病中的作用可能存在差异，需要进一步研究其在不同病理条件下的具体作用路径。

在研究过程中，我们还探讨了实验方法的优化。例如，为了确保实验的准确性，我们采用了多种检测方法，包括血清生化指标分析、肝组织病理学检查、细胞凋亡检测和ROS水平测定。这些方法的综合应用，使得我们能够全面评估B[a]P对肝脏的损伤作用以及槲皮素的干预效果。此外，我们还采用了免疫组化和Western blot等技术，用于检测关键蛋白的表达和功能变化。这些技术的使用确保了实验结果的可靠性和可重复性。

本研究还探讨了实验数据的处理和分析方法。例如，在分析血清生化指标时，我们采用了统计学方法，包括方差分析（ANOVA）和t检验，用于比较不同组之间的差异。在分析肝组织病理学变化时，我们采用了组织学评分系统，用于量化不同组之间的病理变化程度。这些方法的使用确保了实验数据的科学性和客观性。此外，我们还采用了分子生物学技术，如PCR和Western blot，用于检测关键基因和蛋白的表达水平。这些技术的使用为研究提供了重要的分子层面的支持。

在研究过程中，我们还探讨了实验伦理和动物福利问题。实验中使用的动物为雄性C57BL/6J小鼠，所有实验均遵循动物伦理规范，确保动物的福利和实验的合规性。实验方案经过伦理审查，并获得相应的批准。这一伦理审查过程确保了实验的科学性和伦理性，为后续研究提供了重要的法律依据。

本研究还探讨了实验结果的临床意义。例如，B[a]P作为烟草中的代表性肝胆毒性物质，其毒性作用可能通过影响肝脏的代谢和功能，导致慢性肝胆疾病的发生。而槲皮素作为一种天然的中药单体，其在治疗由B[a]P引起的DR方面展现出良好的效果。这一发现为临床治疗提供了新的思路，同时也为中医药在现代医学中的应用提供了重要的科学依据。

通过本研究，我们发现B[a]P的毒性作用主要通过影响BECs的代谢和功能实现。具体而言，B[a]P的代谢激活产物BPDE能够直接结合到14-3-3ε蛋白的Lys123位点，从而抑制其泛素化降解，导致其蛋白水平异常升高。这一现象在实验中得到了验证，表现为14-3-3ε蛋白的表达量显著增加。进一步研究发现，14-3-3ε蛋白的升高能够通过磷酸丝氨酸结合/调控激活VDAC1，导致ER与线粒体之间的异常耦合。这种异常的耦合缩短了两者的距离，进而引发线粒体钙离子过载，最终导致ROS的过量产生。这些过程共同作用，最终促使BECs发生铁死亡，并推动DR的发展。

在靶向干预方面，我们筛选并鉴定出槲皮素这一传统中药单体，该化合物能够高效靶向14-3-3ε蛋白的磷酸丝氨酸结合区域。这一发现为治疗由B[a]P引起的DR提供了新的思路。槲皮素作为一种天然的抗氧化剂，能够有效清除ROS，从而减轻氧化应激对细胞的损伤。此外，槲皮素还具有抗炎特性，能够抑制炎症因子的释放，从而减轻炎症反应对肝脏的损害。这些特性使得槲皮素成为一种潜在的治疗药物，能够在不引起显著副作用的情况下，有效干预由B[a]P引起的DR。

本研究还探讨了槲皮素在不同剂量下的作用效果。结果显示，随着槲皮素剂量的增加，其对B[a]P诱导的铁死亡和DR的抑制作用也逐渐增强。这一现象表明，槲皮素的干预效果可能与剂量相关。然而，过高的剂量可能会导致其他不良反应，因此需要在有效性和安全性之间找到平衡点。通过优化槲皮素的剂量，我们发现其在低剂量下即可有效抑制DR的进展，同时保持较低的毒性。这一发现为临床应用提供了重要的参考依据。

此外，本研究还探讨了实验数据的处理和分析方法。例如，在分析血清生化指标时，我们采用了统计学方法，包括方差分析（ANOVA）和t检验，用于比较不同组之间的差异。在分析肝组织病理学变化时，我们采用了组织学评分系统，用于量化不同组之间的病理变化程度。这些方法的使用确保了实验数据的科学性和客观性。此外，我们还采用了分子生物学技术，如PCR和Western blot，用于检测关键基因和蛋白的表达水平。这些技术的使用为研究提供了重要的分子层面的支持。

在研究过程中，我们还探讨了实验伦理和动物福利问题。实验中使用的动物为雄性C57BL/6J小鼠，所有实验均遵循动物伦理规范，确保动物的福利和实验的合规性。实验方案经过伦理审查，并获得相应的批准。这一伦理审查过程确保了实验的科学性和伦理性，为后续研究提供了重要的法律依据。

本研究还探讨了实验结果的临床意义。例如，B[a]P作为烟草中的代表性肝胆毒性物质，其毒性作用可能通过影响肝脏的代谢和功能，导致慢性肝胆疾病的发生。而槲皮素作为一种天然的中药单体，其在治疗由B[a]P引起的DR方面展现出良好的效果。这一发现为临床治疗提供了新的思路，同时也为中医药在现代医学中的应用提供了重要的科学依据。

综上所述，本研究揭示了B[a]P在诱导DR过程中的关键作用，阐明了其通过影响BECs的代谢和功能，进而引发铁死亡和DR的具体机制。同时，我们筛选并鉴定出槲皮素这一传统中药单体，发现其能够有效干预由B[a]P引起的DR过程。这些发现不仅有助于深入理解烟草吸烟与慢性肝胆疾病之间的关系，也为开发新的治疗策略提供了重要的理论基础和实验支持。未来的研究可以进一步探讨槲皮素在不同疾病中的作用机制，以及其在临床治疗中的应用前景。