不同载脂蛋白B去除血清制备方法对高密度脂蛋白胆固醇外排功能检测的影响分析

《Clinical Chemistry》：A-238 Influence of different apolipoprotein B-depleted serum preparation methods on high-density lipoprotein cholesterol efflux capacity assays

　　为解决传统胆固醇外排能力(CEC)检测方法复杂、阻碍临床应用的问题，研究人员围绕不同apoB去除血清(BDS)制备方法对新型细胞游离ILG法与常规细胞法CEC检测的影响展开研究。结果表明，ILG法不受BDS制备方法影响，而细胞法则对PEG法和肝素法敏感，出现CEC值显著降低或培养基浑浊。此发现对精准评估CVD风险具有重要意义。

　　

在心血管疾病研究领域，高密度脂蛋白的抗动脉粥样硬化功能一直备受关注，其中，胆固醇外排能力被视为衡量其功能优劣的关键指标。然而，传统的CEC检测方法依赖于培养细胞，操作步骤繁琐，重复性难以保证，这极大地限制了其在临床中的广泛应用。为了突破这一瓶颈，研究人员开发出了一种名为“固定化脂质体结合凝胶珠”的新型细胞游离检测法。但无论是新方法还是传统方法，都需要使用经过处理的血清样本——即去除掉载脂蛋白B的血清。问题在于，去除apoB的方法有多种，比如聚乙二醇沉淀法、肝素沉淀法等，哪种方法制备的血清最适合用于CEC检测，目前尚无定论。这种不确定性可能导致检测结果的差异，进而影响对心血管疾病风险的准确评估。因此，系统比较不同BDS制备方法对两种CEC检测技术的影响，对于推动CEC成为可靠的临床生物标志物至关重要。本研究正是针对这一关键问题展开，其成果发表于权威期刊《Clinical Chemistry》。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：通过聚乙二醇、肝素-锰离子、硫酸葡聚糖-镁离子三种化学沉淀法制备apoB去除血清；使用酶法检测血清样本中的总胆固醇和HDL-C浓度；利用蛋白质印迹技术分析载脂蛋白的组成和HDL颗粒的分布；分别应用基于THP-1细胞的传统CEC检测法和新型的细胞游离ILG法来测量胆固醇外排能力；并通过调节肝X受体激动剂来特异性评估ABCA1介导的CEC通路。

RESULTS:

不同BDS制备方法对脂质和载脂蛋白组成的影响

研究人员首先对三种方法制备的BDS进行了成分分析。在脂质水平上，PEG-BDS和Dex-BDS中的总胆固醇浓度与原始血清中的HDL-C浓度相当，这表明这两种方法有效地去除了富含胆固醇的apoB脂蛋白。然而，Hep-BDS中的总胆固醇水平显著高于原始血清的HDL-C，提示肝素-锰沉淀法可能未能完全去除所有非HDL颗粒，或者该方法本身引入了其他含胆固醇的成分。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）对蛋白质组成的分析显示，三种BDS中的载脂蛋白A-I和载脂蛋白E的谱图没有明显差异，并且任何BDS中都几乎检测不到apoB，其含量低于血清中原有水平的10%，证实了所有三种方法在去除apoB方面都具有基本效能。值得注意的是，在所有沉淀物中都检测到了apoA-I，且其相对丰度没有显著差异，这说明部分HDL颗粒在沉淀步骤中损失了。

更为精细的Native-PAGE（非变性电泳）分析揭示了HDL颗粒大小的分布情况。结果显示，Hep-BDS中的HDL颗粒分布与原始血清存在明显区别，而PEG-BDS和Dex-BDS则保持了与原始血清相似的HDL颗粒谱。这表明肝素-锰沉淀法可能在制备过程中改变了HDL的物理结构或组成，而其他两种方法对HDL颗粒的完整性影响较小。

不同BDS制备方法对ILG法CEC检测的影响

接下来，研究团队评估了BDS制备方法对新型ILG法测量CEC结果的影响。实验结果表明，使用原始血清以及三种不同方法制备的BDS，通过ILG法测得的CEC值具有可比性。这意味着，对于这种不依赖细胞的检测技术而言，选择PEG、肝素还是硫酸葡聚糖方法来制备血清样本，并不会对最终的CEC测量结果产生显著影响。ILG法展现出了对样本前处理方法良好的耐受性，这是一个非常有利于标准化和临床应用的优点。

不同BDS制备方法对细胞依赖法CEC检测的影响

与ILG法的稳健性形成鲜明对比的是，传统的细胞依赖法对BDS的制备方法表现出高度敏感性。当使用THP-1细胞进行CEC检测时，研究人员观察到了显著差异。 specifically，为了评估ABCA1这一特定通路介导的胆固醇外排，他们通过调节肝X受体来上调细胞表面的ABCA1表达。结果显示，与原始血清相比，PEG-BDS测得的ABCA1介导的CEC值出现了大幅下降，降幅约为56%。这强烈暗示PEG沉淀过程可能损害了HDL中负责通过ABCA1途径接受胆固醇的功能组分。

此外，Hep-BDS在细胞培养实验中引发了另一个棘手的问题——培养基变得浑浊。这种浑浊现象很可能源于肝素-锰试剂与培养基成分发生相互作用，形成不溶性复合物。浑浊的培养基会严重干扰基于荧光探针（如本研究使用的BODIPY标记胆固醇）的检测信号，导致读数不准，甚至使得实验无法进行。因此，肝素法制备的BDS实际上并不适用于基于细胞的CEC检测体系。

CONCLUSION:

本研究系统地探讨了三种常见的apoB去除血清制备方法对两种CEC检测技术的影响。核心结论是：新型的细胞游离ILG法对BDS的制备方法不敏感，使用PEG、肝素或硫酸葡聚糖法制备的样本均能得到一致的CEC结果，凸显了其在方法标准化方面的潜在优势。而传统的细胞依赖法则严重受制于BDS的制备选择，PEG法会显著抑制ABCA1特异性的CEC信号，肝素法则因引起培养基浑浊而干扰检测。

这些发现具有重要的实践意义。它警示研究人员和临床检验工作者，在选择和建立CEC检测方法时，必须审慎考虑样本前处理步骤。尤其当使用细胞模型时，PEG法和肝素法都可能引入偏差或技术障碍，从而影响对HDL功能的真实评价以及后续对心血管疾病风险的判断。本研究不仅为CEC检测的标准化提供了关键实验证据，也凸显了ILG这类细胞游离检测方法在克服传统技术局限、推动生物标志物临床应用方面的巨大潜力。未来研究需要进一步揭示不同沉淀试剂影响HDL功能的具体分子机制，并验证这些方法学差异是否最终会影响CEC在大型流行病学队列中预测心血管疾病风险的效能。