NDM-1质粒聚类揭示柏林四家医院肺炎克雷伯菌ST147克隆传播机制

　　本研究针对柏林多家医院NDM-1型肺炎克雷伯菌增多现象，通过全基因组测序与质粒分析技术，揭示其传播主要依赖克隆扩散而非质粒水平转移，发现全球流行性质粒p1的本地化传播，为医院感染防控提供重要分子流行病学依据。

　　

近年来，医疗环境中出现了一个令人担忧的趋势——产新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, KLPN）感染病例显著增加，尤其是在德国柏林地区。这种细菌能水解碳青霉烯类抗生素（通常被视为治疗多重耐药菌感染的最后一道防线），导致临床治疗选择极其有限。更令人头痛的是，NDM耐药基因往往通过质粒这种可移动遗传元件在不同细菌间传播，就像特洛伊木马一样悄悄扩散耐药性。

2021至2024年间，柏林夏里特医学院附属的四家医院陆续发现了大量携带NDM-1的肺炎克雷伯菌 isolates。这些病例分散在不同院区，时间跨度长，这让研究人员不禁怀疑：这究竟是一场跨越多家医院的单一质粒介导的传播事件，还是多个独立的克隆暴发？这个问题至关重要，因为如果是由一个“超级质粒”引起的传播，意味着需要采取完全不同的感染控制策略。

为了解开这个谜团，Anna Weber教授团队开展了一项深入的分子流行病学研究。他们对57株NDM-1阳性肺炎克雷伯菌进行了全基因组测序，结合长短读长测序技术（Illumina和Oxford Nanopore），通过核心基因组多位点序列分型（cgMLST）和质粒特征分析，揭示了这些耐药菌的传播真相。

研究人员采用的主要技术方法包括：对全部57株菌进行短读长测序（Illumina MiSeq平台），选取4株代表性菌株进行长读长测序（Oxford Nanopore MinION平台）以获得杂交组装；使用SeqSphere+软件进行cgMLST分型分析；通过MOB-suite工具进行质粒特征鉴定；利用TaDReP工具重建NDM-1参考质粒；采用Snippy进行核心基因组SNP分析并构建系统发育树。所有菌株来自2021-2024年间柏林四家医院的临床样本、筛查样本和环境样本。

克隆水平分析揭示三个独立暴发集群

通过cgMLST分析，研究人员发现了三个清晰的暴发集群（O1-O3）。最大的集群O1包含41个分离株，分布在A、B、C三个院区，时间跨度从2021年持续到2024年。集群O2包含9个分离株，主要来自A院区的内科重症监护和肾病科，出现在2023年底至2024年。集群O3则包含4个分离株，全部来自D院区的心脏中心，仅限于2023年。

系统发育分析进一步证实了这三个克隆集群的遗传独立性。有趣的是，这些集群对应着不同的序列型：O1和O2都属于ST147（德国常见的高风险克隆），而O3则属于ST395。毒力基因分析显示，O2集群的菌株具有更高的毒力评分，携带yersiniabactin（ybt）、aerobactin（iuc）和colibactin（clb）等毒力因子，而O3集群则表现出hypervirulent（高毒力）特征。

质粒分析显示克隆特异性传播

研究的关键部分是对NDM-1编码质粒的深入分析。通过长读长测序和TaDReP工具，研究人员重建了三个不同的NDM-1参考质粒：p1（54.0 kb，IncFIB(pQil)型）、p2（54.3 kb，IncR型）和p3（355.5 kb，未指定Inc型）。每个质粒都与其对应的克隆集群完美匹配——p1专门存在于O1集群，p2对应于O2集群，p3则专门存在于O3集群。

对p1和p2的详细比较发现，虽然这两个质粒大小相似，但在结构上存在显著差异。它们在中部区域显示高度同线性（synteny），包含多个保守基因（复制、稳定性和耐药相关基因），但在插入序列（IS elements）和特定基因（如repA、folP、emrE、cat）的存在与否方面有明显区别。

当研究人员将短读长数据与这些参考质粒进行比对时，发现64%的NDM-1质粒都能归入这三个参考质粒之一，其中p1占比最高（47%）。重要的是，没有发现任何质粒在不同克隆集群间交叉传播的证据。

全球流行性质粒的本地化传播

通过NCBI BLAST比对，研究人员发现p1质粒与多个国家报道的质株高度相似（序列一致性>99%），包括俄罗斯（CP125103.1）、意大利（CP098430.1； CP072928.1）、美国（CP074090.1）、日本（LC521845.1； AP018834.1）、瑞士（CP082992.1）和克罗地亚（OZ111522.1）的分离株。这表明p1是一个全球分布的NDM-1质粒，可能通过国际旅行或患者转移传入柏林地区。相比之下，p2和p3质粒在数据库中找不到高度相似的匹配项，可能是相对较新或地域性较强的质粒。

研究还发现，约36%的NDM-1质株无法归入这三个参考质粒，其中还包括一个可能的新质粒集群（大小16.8 kb，无指定Inc型），这些都显示了NDM-1质粒在医院的多样性。

这项研究最终得出结论：柏林四家医院的NDM-1肺炎克雷伯菌传播并非由单一质粒介导的跨院区传播，而是由三个独立的克隆暴发事件组成，每个克隆都携带其特有的NDM-1质粒。这一发现具有重要的临床意义——它表明当前的传播主要是通过患者间克隆扩散而非质粒水平转移，因此感染控制措施应重点关注限制患者间的直接传播而非质粒控制。

研究人员特别指出，ST147作为全球高风险克隆，在德国NDM-1传播中扮演了关键角色。近年来该克隆在德国的增多可能与乌克兰战争相关的患者转移有关，这提示跨境传播仍是耐药菌扩散的重要途径。同时，高毒力菌株（如ST395）的出现增加了治疗的复杂性，虽然本研究未发现同时携带耐药和毒力基因的"超级质粒"，但这种风险始终存在。

这项研究的价值在于它展示了如何结合克隆分型和质粒分析来揭示耐药菌的传播 dynamics。对于医院感染控制团队而言，这种分子水平的洞察力能够指导更有针对性的干预措施。在抗生素耐药性日益严重的今天，理解耐药基因的传播机制不仅是科学问题，更是公共卫生的迫切需求。

该研究发表于《Antimicrobial Resistance & Infection Control》杂志，为医院感染防控提供了重要的科学依据，也为未来监测和控制碳青霉烯酶耐药菌传播提供了新的思路和方法。