PBN-CeA-脾轴通过神经免疫调控机制影响脓毒症相关谵妄的新发现

　　本研究针对脓毒症相关谵妄(SAD)的中枢调控机制不明的问题，通过探索臂旁核(PBN)-中央杏仁核(CeA)-脾轴在SAD发病中的作用，发现该轴作为连接中枢神经环路与外周免疫调节的关键神经免疫通道。研究人员采用免疫荧光、神经示踪、光纤光度测定和电生理记录等技术，证实LPS刺激激活CeA神经元和脾交感神经，靶向抑制PBN-CeA通路可减轻谵妄样行为，逆转脾促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ)和去甲肾上腺素(NE)水平，恢复免疫细胞组成并增强NK细胞功能，为神经调节全身炎症和SAD发病机制提供了新的 mechanistic 见解。

　　

脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起，死亡率高达30%-50%，是全球健康的重大挑战。其发病率不断上升，部分原因是人口老龄化，伴随着多器官功能障碍综合征(MODS)和持久认知损伤的易感性增加。在脓毒症的并发症中，脓毒症相关谵妄(SAD)是最常见的急性脑功能障碍，影响30%-70%的脓毒症患者，与院内死亡率增加和持续性神经认知缺陷密切相关。尽管SAD的发病机制涉及多因素过程，如血脑屏障(BBB)的神经炎症激活和免疫代谢失调，但协调这些事件的核心调控回路仍不明确。

近年来，权威研究逐渐揭示神经和免疫系统在分子、细胞和器官水平上进行双向通信，深刻影响免疫稳态。这些相互作用越来越被认为是脓毒症免疫功能障碍的关键调节因子，并代表了解决炎症和免疫抑制的潜在治疗切入点。其中，脑-脾轴作为中枢-外周免疫通信的关键接口日益突出。脾作为最大的次级淋巴器官，占总体淋巴组织的25%，协调细胞和体液免疫反应，在脓毒症期间塑造宿主的免疫轨迹中起着至关重要的作用。神经解剖追踪显示，中央杏仁核(CeA) among 大脑区域中拥有最密集的脾神经投射。CeA中表达 corticotropin-releasing hormone (CRH) 的神经元的光遗传学刺激可迅速激活脾神经，随后通过α9 nicotinic acetylcholine receptor (α9nAChR) 介导的信号传导增强B细胞分化为浆细胞，并促进抗原特异性抗体产生。同时，CeA起源的胆碱能投射到迷走神经背核(DMV)动态调节脾淋巴细胞组成。γ-aminobutyric acid (GABA) 能的CeA神经元可以抑制胆碱能DMV活性，从而减少脾Th2细胞群体并减弱抗炎反应。这种双向神经调节在脓毒症中可能特别相关，其中从早期高炎症状态到晚期免疫抑制的时间转变可能反映了CeA-脾神经回路内的失调。这些见解将CeA确定为神经免疫调节的候选枢纽和逆转脓毒症诱导的免疫抑制及缓解SAD的有希望的治疗靶点。

臂旁核(PBN)位于脑干，是处理伤害性和内脏感觉输入的关键整合中心。它由异质神经元群体组成，主要是谷氨酸能神经元，以及较小的GABA能和 calcitonin gene-related peptide (CGRP) 表达神经元子集。谷氨酸能神经元约占PBN神经元的85%，对于介导与觉醒相关的行为和脑电图反应至关重要。GABA能神经元虽然较少，但对局部兴奋回路施加抑制控制，并受到来自终纹床核(BNST)等上游输入的调节，这些输入促进摄取并缓解焦虑。CGRP阳性的PBN神经元，其中许多共表达谷氨酸，作为对各种厌恶刺激（包括内脏不适）的通用警报响应者。PBN广泛投射到CeA。这种PBN-CeA连接已成为神经免疫信号传导中的关键调节因子。在盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症模型中，PBN和CeA均显示c-Fos蛋白表达增加。在急性应激下，PBN神经元可以短暂增强CeA中的GABA能传递。大约50%的表达CRH的CeA神经元接收直接的PBN输入，并且从PBN末端释放的CGRP可能通过CeA-CRH信号通路调节脾交感输出。这种PBN-CeA-脾通路可能构成SAD中外周免疫激活和中枢神经炎症之间病理反馈回路的机制基础。

基于此，研究人员假设PBN-CeA-脾轴是导致SAD发病机制的中枢神经免疫导管。为了验证这一点，他们在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中检查了PBN-CeA投射的解剖和功能连接及其对脾神经活动的调节。通过使用化学遗传抑制PBN-CeA投射和手术脾去神经，他们观察到谵妄样行为的显著减轻。互补的免疫学分析使用流式细胞术和酶联免疫吸附测定(ELISA)进一步揭示了外周炎症细胞因子水平和免疫细胞稳态的显著恢复。这些发现将PBN-CeA-脾轴确定为脓毒症中的关键神经免疫调节通路，为减轻SAD提供了机制见解和潜在治疗靶点。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过免疫荧光分析鉴定PBN和CeA的激活模式；使用双向神经示踪研究区域之间的直接解剖连接；通过光纤光度测定和电生理记录进行功能探究；利用行为测定评估靶向抑制PBN-CeA通路对脓毒症小鼠谵妄的影响；采用ELISA和流式细胞术进行免疫分析。动物模型使用C57BL/6小鼠，通过腹腔注射LPS(10 mg/kg)诱导SAD。

研究结果首先验证了C57BL/6J小鼠中PBN-CeA的连接。通过双向跨单突触示踪技术，确认了从PBN到CeA的解剖通路。前向示踪显示，在PBN注射rAAV2/1-hSyn-CRE，在CeA注射rAAV2/9-hSyn-DIO-mCherry后，在CeA的神经元胞体中观察到强大的mCherry表达，表明PBN起源投射的成功前向跨突触标记。逆向示踪显示，在CeA注射rAAV2/retro-hSyn-CRE，在PBN注射rAAV2/9-hSyn-DIO-mCherry后，免疫荧光显示PBN神经元中有大量的mCherry表达，与VGAT、VGLUT2和CGRP共标记，符合PBN中伤害性刺激的神经编码。此外，将逆向跨突触示踪剂 pseudorabies virus (PRV-CAG-EGFP) 注射到脾中，验证了CeA对脾功能的神经控制，随后在CeA区域检测到强大的PRV荧光。

LPS刺激后PBN-CeA轴的时间依赖性激活显示，在腹腔注射LPS(10 mg/kg)后，PBN和CeA的c-Fos阳性神经元显著增加，在6小时和24小时达到峰值，7天后恢复到基线，表明PBN-CeA回路可能参与急性神经免疫信号传导。

化学遗传抑制PBN-CeA通路可逆转LPS诱导的CeA钙高活动性。通过将CRE依赖的hM4D(Gi)-AAV注射到PBN，而将逆向CRE表达载体注射到CeA，并在CeA中共表达GCaMP6s进行实时钙成像，发现化学遗传抑制PBN-CeA通路显著减少了脓毒症诱导的CeA神经元c-Fos表达。在LPS刺激后，CeA钙瞬变显著增加，而CNO给药导致CeA钙活动显著减少，证实了PBN-CeA通路的功能参与。

PBN-CeA通路调节LPS诱导的脾交感神经活动升高。通过体内电生理记录脾神经活动，发现LPS刺激后脾神经放电率显著增加，而化学遗传抑制PBN-CeA通路通过CNO给药导致脾神经活动的强烈抑制，逆转了LPS诱导的交感兴奋。

脓毒症相关谵妄的行为缺陷通过化学遗传抑制PBN-CeA通路或脾去神经得到改善。行为测试显示，脾去神经和PBN-CeA通路抑制均减轻了脓毒症诱导的探索行为(OFT)、空间记忆(Y迷宫)和自发动机(BFST)缺陷。复合Z评分分析表明，这些干预显著改善了脓毒症小鼠的谵妄样行为。

化学遗传抑制PBN-CeA通路或脾去神经可影响脓毒症小鼠的炎症细胞因子水平。ELISA分析显示，LPS administration 触发了所有五种细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ)的显著升高。脾去神经和PBN-CeA通路抑制均显著降低了血清和脾中的TNF-α和IL-1β水平，而PBN-CeA通路抑制还降低了IL-6和IL-10水平。在脾微环境中，两种干预都有效减弱了LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β上调，同时恢复了IFN-γ表达。

去甲肾上腺素(NE)水平测量显示，LPS刺激显著升高了血清NE水平，但脾去神经或PBN-CeA通路抑制未显著改变循环NE水平。相反，脾NE水平在去神经小鼠和脓毒症小鼠中显著降低，而两种干预都逆转了这种减少，导致脾NE水平显著高于对照组。

PBN-CeA通路抑制和脾去神经恢复免疫细胞组成并增强NK细胞成熟。流式细胞术分析显示，脓毒症导致脾淋巴细胞组成的显著改变，包括T细胞、NKT细胞和NK细胞的减少，以及B细胞的增加。两种干预都显著恢复了脾NK细胞和T细胞比例，并正常化了B细胞频率。NK细胞成熟评估显示，脓毒症损害了脾中NK细胞的成熟，表现为过渡性CD27⁺CD11b⁺ NK细胞增加和终末分化CD27^-CD11b⁺ NK细胞减少。两种干预都纠正了这种失衡，通过增强CD27⁺CD11b⁺亚群并恢复终末分化CD27^-CD11b⁺亚群。

讨论部分指出，神经免疫失衡日益被认为是脓毒症免疫失调的关键机制。作为这种失衡的临床表现，SAD的特征是中枢神经系统(CNS)和外周免疫反应之间双向神经免疫通信的中断。本研究采用三种互补的方法——神经解剖示踪、化学遗传干预和多模式免疫分析，将PBN-CeA-脾轴确定为参与SAD发病机制的新神经通路。这些发现为双向神经免疫调节理论提供了实验验证。

作为最大的外周免疫器官，脑-脾轴介导的脾免疫功能调节在脓毒症免疫失调中起着关键作用。实验数据表明，LPS暴露增强了CeA钙信号并显著增加了脾神经放电。PBN-CeA谷氨酸能通路的化学遗传抑制逆转了这两种效应，证实了其上游调节作用。此外，LPS诱导的脾中NE耗竭——可能反映了交感神经过度激活导致的神经递质衰竭——被脾去神经和PBN-CeA通路抑制所挽救。这些发现共同验证了PBN-CeA-脾轴在协调脾交感输出和维持NE稳态中的作用，这是神经免疫张力的关键调节因子。

本研究阐明了先前未被认识的PBN-CeA-脾轴在SAD发病机制中的作用。在行为范式中，PBN-CeA抑制和脾去神经都改善了脓毒症诱导的空间记忆(Y迷宫)和探索行为(OFT)缺陷。值得注意的是，只有PBN-CeA抑制改善了脓毒症小鼠的自发动机行为(BFST)。这些结果与先前的研究一致，即CeA是整合情绪信号和协调行为反应的关键枢纽，同时也是脑-脾轴连接的关键节点。CeA通路调节影响运动(OFT)和认知(Y迷宫)功能域。从机制上讲，脾去神经可能通过抑制促炎细胞因子的产生来减轻神经炎症，从而改善空间记忆巩固。

细胞因子分析揭示了PBN-CeA抑制与脾去神经诱导的不同调节模式。两种干预都抑制了血清和脾中的关键促炎细胞因子(TNF-α和IL-1β)。然而，PBN-CeA抑制产生了更广泛的效果，显著降低了两个区室中的IL-6和IL-10。这种差异细胞因子调节表明，该通路的中央调节可能协调更全局的系统免疫张力重新平衡。这些发现补充了最近的发现，即PBN-CeA环激活驱动双重病理效应：脾神经介导的促炎因子释放(如TNF-α、IL-1β)和IL-10依赖的抗炎通路抑制。靶向通路抑制因此可能破坏脓毒症中的这种“免疫恶性循环”。值得注意的是，血清和脾之间 contrasting 的IL-10表达模式可能反映了胆碱能抗炎通路和交感激活之间的时空竞争。

流式细胞分析表明，脓毒症诱导了脾淋巴细胞组成的深刻转变，以NK和T细胞的减少和B细胞的增加为标志。两种干预(CDL和GiSL)都恢复了T和NK细胞比例并正常化了B细胞频率。对改变最显著的细胞群体的亚型分析显示，脾去神经显著减少了脓毒症小鼠的生发中心数量，而PBN-CeA抑制 specifically 改善了记忆B细胞水平。此外，脓毒症损害了脾中NK细胞的成熟，表现为过渡性CD27⁺CD11b⁺ NK细胞比例增加和终末分化CD27^-CD11b⁺ NK细胞比例减少。这种 skewed 成熟模式表明向细胞毒性效应表型转变的停滞。这种破坏与先前的报告一致，即NE剂量依赖性地降低NK细胞毒性、穿孔素和颗粒酶B表达以及IFN-γ产生——这些效应可被β2-肾上腺素能拮抗剂逆转。CDL和GiSL干预都可以通过局部减弱脾交感信号传导来进一步增加过渡性CD27⁺CD11b⁺ NK细胞比例并恢复终末分化CD27^-CD11b⁺ NK细胞比例，从而导致小鼠脾中IFN-γ水平升高。先前的研究表明，脓毒症进展期间的NK细胞功能障碍与增加的继发感染风险和死亡率相关，调节该通路可能为脓毒症诱导的免疫失调提供新的治疗靶点。

所有实验均使用成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周)。他们采用腹腔LPS给药(10 mg/kg)而不是CLP，以减少CLP手术对行为测试的影响。LPS给药也常用于其他类似研究。脾神经在脓毒症发病机制中的双重免疫调节作用在机制上仍然难以捉摸且矛盾未解，尽管其具有关键的治疗相关性。本研究系统地描述了脓毒症中PBN-CeA-脾轴的神经免疫网络，但有几个局限性需要注意。首先， exclusively 关注早期脓毒症限制了我们对长期神经免疫适应的理解。其次，该电路下游的细胞因子和免疫细胞调节的分子基础尚未阐明。未来的研究应整合单细胞转录组分析，以解码神经调节下的脾免疫细胞异质性。光遗传学和药物遗传学技术的整合将进一步 enable 时空剖析PBN-CeA电路。

结论部分总结，本研究将PBN-CeA-脾轴确定为驱动脓毒症相关谵妄病理生理学的神经免疫回路。通过协调脾交感输出和外周免疫反应，该通路介导了中枢神经炎症和系统免疫抑制之间的动态相互作用。该轴的化学遗传和手术破坏减弱了适应不良的细胞因子释放，恢复了免疫细胞稳态，并改善了脓毒症诱导的行为缺陷。这些发现为开发针对脓毒症诱导的免疫麻痹和相关神经并发症的精确神经调节策略 delineate 了一个新的机制框架。