m6A调控肿瘤细胞VISTA通过STAT3/CCL22轴重塑非小细胞肺癌免疫微环境的作用与机制研究

　　本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)免疫治疗中存在的免疫逃逸难题，通过生物信息学分析和实验验证，首次系统揭示了m6A甲基化修饰通过METTL3/YTHDF1轴调控免疫检查点VISTA在肿瘤细胞表面表达的分子机制，并发现VISTA通过抑制STAT3磷酸化减少CCL22分泌，从而增强CD8+T细胞毒性、减少Treg细胞浸润，显著改善肿瘤免疫微环境。该研究为NSCLC免疫治疗提供了新的潜在靶点和联合治疗策略，具有重要的临床转化价值。

　　

肺癌，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)，是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管近年来免疫治疗取得了显著进展，但免疫逃逸导致的治疗抵抗和预后不佳仍然是临床面临的重大挑战。深入研究NSCLC免疫微环境的调控机制，对于提高治疗效果具有重要意义。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA中最常见的转录后修饰之一，参与调控mRNA的稳定性、翻译效率和剪接等过程，在肿瘤发生发展和免疫微环境调控中扮演着关键角色。VISTA(V-domain Immunoglobulin Suppressor of T cell Activation)是一种重要的免疫检查点分子，既在免疫细胞上表达，也在肿瘤细胞表面表达，但其在NSCLC中的具体功能和调控机制尚不完全清楚。

为了探索m6A相关分子在NSCLC免疫治疗中的作用机制，由Xu Hao和Shen Kaikai共同第一作者、Wang Dong、Song Yong和Lv Tangfeng为共同通讯作者的研究团队在《Journal of Translational Medicine》上发表了最新研究成果。研究人员通过对GEO数据库中的免疫治疗数据集GSE126044进行生物信息学分析，结合加权基因共表达网络分析(WGCNA)和LASSO-Cox回归模型，筛选出与免疫治疗疗效相关的关键分子VISTA。

研究采用的主要技术方法包括：利用GSE126044数据集（包含15例男性、3例女性患者，平均年龄64岁，9例鳞癌、9例腺癌，5例DCB和11例NDB样本）进行生物信息学分析；通过m6A点杂交、MeRIP、RNA pull-down和RNA稳定性实验验证m6A修饰；使用CCK-8、伤口愈合、Transwell实验和流式细胞术评估肿瘤细胞生物学行为；通过RNA测序筛选下游通路和细胞因子；最后在动物模型中进行体内验证。

Identify the DEGs associated with m6A modification in GSE126044

研究人员首先对GSE126044数据集进行差异表达分析，共鉴定出721个差异表达基因(DEGs)，其中581个基因上调，140个基因下调。基因富集分析(GO和KEGG)显示这些DEGs与免疫相关过程密切相关。通过WGCNA分析筛选出与免疫治疗最相关的模块thistle2，并与m6A修饰基因集取交集，最终获得72个候选分子。

VISTA is a potential therapeutic target for DCB and NDB in NSCLC

LASSO回归分析从72个分子中筛选出两个重要候选分子：VSIR(VISTA)和HLA-E。多因素生存分析显示VISTA具有统计学显著效应，KM曲线和ROC曲线进一步证实了其临床相关性。研究发现VISTA在DCB组中的表达显著高于NDB组，TIMER分析证实其与免疫细胞密切相关。多位点免疫荧光分析显示VISTA在DCB组中表达增加，且与METTL3密切相关。

METTL3 is positively correlated with VISTA

数据库分析证实VISTA在NSCLC中的表达降低。在A549、H1299、H460和BEAS-2B细胞系中的定量和蛋白分析进一步验证了VISTA在肿瘤细胞系中的低表达水平。通过METTL3的过表达和敲低实验，发现在A549和H1299细胞中，METTL3与VISTA在RNA和蛋白水平均呈正相关。

METTL3 and YTHDF1 influence the expression of VISTA through m6A modification

在A549和H1299细胞系中，METTL3过表达导致m6A修饰水平显著增加。通过人类m6A-seq数据集(GSE161090)确定m6A修饰位点位于3'UTR区域。MeRIP实验表明METTL3过表达增加了VISTA mRNA的m6A修饰水平。研究人员进一步鉴定出潜在的m6A阅读蛋白YTHDF1和IGF2BP1，发现敲低YTHDF1能够显著降低VISTA RNA表达，而敲低IGF2BP1则无显著影响。RNA pull-down实验证实YTHDF1与VISTA mRNA存在相互作用，放线菌素D实验表明YTHDF1敲低后VISTA mRNA降解增加。

Overexpression of VISTA on TCs enhances the cytotoxicity of CD8⁺T cells

VISTA过表达在RNA和蛋白水平得到验证。CCK-8、伤口愈合和Transwell实验未发现OE-NC和OE-VISTA组间有统计学显著差异。流式细胞术分析显示，与PBMCs共培养后，VISTA过表达增强了肿瘤细胞死亡，CD107a和CD69分析表明CD8⁺T细胞被激活。

VISTA affects CD8⁺T cells by inhibiting STAT3 phosphorylation/reducing CCL22 expression

对过表达VISTA的A549细胞进行RNA测序，GSEA富集分析显示与JAK/STAT信号通路密切相关。差异分析发现VISTA过表达后CCL22水平显著降低。将A549细胞分为OE-NC、OE-VISTA和OE-VISTA+sti-STAT3三组，WB分析显示OE-VISTA组STAT3磷酸化水平降低，而OE-VISTA+sti-STAT3组磷酸化水平增加。ELISA分析显示OE-VISTA组上清液中CCL22水平显著降低，而OE-VISTA+sti-STAT3处理后明显增加。共培养实验表明，增加的肿瘤细胞毒性和T细胞活性可被sti-STAT3处理所挽救。

VISTA on TCs inhibits tumor growth in vivo and enhances sensitivity to anti-PD-L1 therapy

首先验证了LLC稳定细胞系中VISTA过表达的效率。将小鼠分为两批：第一批为OE-NC、OE-NC+anti-PD-L1、OE-VISTA和OE-VISTA+anti-PD-L1组；第二批为OE-NC、OE-VISTA和OE-VISTA+sti-STAT3组。定期给予抗PD-L1和Colivelin，监测肿瘤大小。发现在第一批中，OE-VISTA组内注射和未注射抗PD-L1亚组间无显著差异，而其他组间差异明显；第二批中，三组间均观察到显著差异。进一步验证发现，OE-VISTA组STAT3磷酸化水平降低，注射Colivel后磷酸化水平显著增加。肿瘤组织研磨上清液ELISA检测显示OE-VISTA组CCL22表达水平降低，注射Colivelin后CCL22表达显著增加。TUNEL染色表明OE-VISTA组细胞死亡增加，OE-VISTA+sti-STAT3组较OE-VISTA组细胞死亡减少。CD3染色显示OE-VISTA组T细胞积累增加，IFN-γ和GZMB水平升高表明T细胞毒性增强，而OE-VISTA+sti-STAT3组T细胞积累减少、毒性降低。多位点免疫荧光检测CD4和FOXP3评估Tregs状态，结果显示OE-VISTA组Tregs显著减少，而OE-VISTA+sti-STAT3组较OE-VISTA组Tregs显著增加。

本研究首次系统性地研究了VISTA在NSCLC肿瘤细胞上的表达、功能和分子机制，提出了在肿瘤免疫微环境中，VISTA不仅作为免疫检查点，还通过其在肿瘤细胞上的表达来调节CD8⁺T细胞的活化/招募和Treg细胞的招募。研究发现m6A甲基转移酶METTL3通过增强VISTA mRNA的m6A修饰水平，被阅读蛋白YTHDF1识别后提高VISTA mRNA稳定性，导致肿瘤细胞表面VISTA蛋白表达增加。VISTA通过STAT3/CCL22轴促进CD8⁺T细胞的富集和活性，减少调节性T细胞(Tregs)在免疫微环境中的富集，从而增强对免疫治疗的敏感性。

该研究的重要意义在于揭示了m6A-VISTA-STAT3-CCL22轴在调控NSCLC免疫微环境中的关键作用，为理解免疫检查点分子在不同细胞类型中的双重功能提供了新的视角。研究结果不仅为NSCLC免疫治疗提供了新的潜在靶点，也为联合治疗策略的开发提供了理论依据。特别是发现VISTA在肿瘤细胞上的表达可能发挥与在免疫细胞上不同的功能，这一发现对于未来针对VISTA的靶向治疗策略具有重要的指导意义，提示需要根据VISTA的具体表达细胞类型和肿瘤类型来设计精准的治疗方案。

研究的局限性包括临床数据主要来源于GEO数据库，自身临床样本有限且随访不足；未探讨VISTA与其他免疫检查点（如PD-1/PD-L1）的潜在关系；在观察到肿瘤细胞上VISTA表达增加后，未研究其与哪种胞外配体结合触发细胞内变化；虽然VISTA抑制STAT3磷酸化，但除CCL22外是否还有其他细胞因子发生变化仍需进一步研究；未建立PDX模型和/或类器官模型。肿瘤免疫微环境由多种细胞类型组成，每种细胞都有独特的分子表达和不同的生物学功能，未来研究应采用单细胞测序和/或空间转录组学进一步探索这些方面。