胰腺癌微生物-代谢组互作机制：多组学揭示假单胞菌调控氨基酸代谢的新作用

　　本研究针对胰腺癌(PC)中肿瘤内微生物组与代谢网络相互作用的机制空白，通过整合16S rDNA测序和非靶向代谢组学技术，对47对胰腺癌及癌旁组织进行分析。研究发现假单胞菌(Pseudomonas)为胰腺癌优势菌属，并鉴定出298个显著差异代谢物，主要富集于氨基酸代谢通路。相关性分析揭示假单胞菌与支链氨基酸代谢产物α-酮异戊酸(Alpha-ketoisovaleric acid)等显著相关，表明微生物-代谢物互作网络可能通过调节mTOR和IRE1信号通路影响肿瘤进展。该研究为胰腺癌的微生物靶向治疗提供了新的理论依据。

　　

胰腺癌被称为"癌中之王"，其5年生存率仅为13%，是预后最差的恶性肿瘤之一。预计到2040年，它将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。目前胰腺癌的标准治疗包括手术、化疗、免疫治疗和靶向治疗，但由于早期症状隐匿，大多数患者确诊时已处于局部晚期或转移阶段，失去手术机会。即使能够进行根治性手术，约80%的患者会在术后2年内复发。化疗反应率仅30%，且容易产生耐药，只有极少数患者能从免疫治疗和靶向治疗中获益。

胰腺癌肿瘤微环境(TME)的一个显著特征是癌细胞内外机制的复杂相互作用，形成了以密集细胞外基质、代谢重编程和显著免疫抑制为特征的TME。为适应严重缺氧环境，癌细胞改变了代谢表型以维持生存和增殖，包括增强糖酵解代谢、谷氨酰胺代谢和脂肪酸代谢。癌细胞的适应性代谢变化不仅促进自身生存，还影响TME中的肿瘤浸润免疫细胞，导致免疫抑制微环境并诱导肿瘤免疫治疗耐药。

近年来，研究发现肿瘤内微生物群与宿主代谢状态密切相关，这种相互作用可能影响肿瘤代谢重编程。肿瘤内微生物通过参与体内代谢反应、调节癌症相关信号通路以及影响宿主细胞功能和免疫系统，发挥促肿瘤或抑瘤作用。微生物衍生代谢物作为宿主-微生物相互作用的重要介质，在生理功能和免疫环境中发挥着深远作用。

尽管现有研究主要集中在单个微生物或代谢物与胰腺癌的关联上，但控制它们动态相互作用的因果机制（如特定微生物群落如何介导致癌代谢物合成）仍然缺乏系统研究。传统的单组学方法无法捕捉多面生物分子网络中的复杂相互作用，导致对宿主-微生物代谢串扰的见解零散。因此，系统绘制胰腺癌中肿瘤内微生物群与代谢之间的相互作用对于推进该疾病的早期诊断和靶向治疗至关重要。

本研究通过整合16S rDNA测序（微生物组）和非靶向代谢组学数据，系统揭示胰腺癌组织中的微生物-代谢物相互作用网络，并阐明其在肿瘤进展中的作用。

研究人员为开展本研究采用了几个关键技术方法：使用47对来自医院的胰腺癌和癌旁组织样本进行16S rDNA测序和非靶向代谢组学分析；通过QIIME2软件进行微生物群落α多样性和β多样性分析；利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和变量重要性投影(VIP)筛选差异代谢物；采用LEfSe分析鉴定组间差异微生物；通过Spearman相关性分析构建微生物-代谢物互作网络。

微生物组分析揭示胰腺癌与癌旁组织间微生物群落的显著差异

研究发现胰腺癌组织(T组)与癌旁组织(N组)在检测到的物种数量上存在差异。

通过Shannon和Simpson指数进行的α多样性分析以及基于Braycurtis距离的ANOSIM分析和PCOA分析表明，癌组织与癌旁组织在α多样性和β多样性上存在显著差异。这些结果揭示了癌组织与癌旁组织在物种丰富度和群落组成上的显著差异，表明两组间具有不同的肿瘤内微生物组成。

LEfSe分析用于确定两组间的优势物种。使用LDA得分>2作为筛选标准，发现胰腺癌肿瘤内组织中的优势物种是假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞菌科(Pseudomonadacea)和假单胞菌属(Pseudomonas)，而癌旁组织中的优势物种是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、莫拉克斯菌科(Moraxellaceae)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、气单胞菌目(Aeromonadales)和气单胞菌属(Aeromonas)。

基于计算机计算的KEGG分析强调了胰腺癌中的几个关键代谢途径：精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、阳离子抗菌肽(CAMP)耐药、香叶醇降解、谷氨酸能突触、GABA能突触和坏死性凋亡。

代谢组学结果显示胰腺癌中显著不同的代谢物及其通路

使用非靶向代谢组学比较胰腺癌组(T)和癌旁组(N)之间的代谢物差异。模型表现出良好的稳定性和有效性。

火山图鉴定出两组间298个显著差异代谢物，包括上调和下调的代谢物。

代谢物差异分析显示，阳性离子模式下癌组织中显著上调的代谢物包括：扎来普隆、D-赤藓糖咪唑基 glycol 磷酸酯、多巴酚丁胺、Pro-Hyp、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、N-甲基烟酰胺、特布他林、辛酰肉碱和色氨酸甜菜碱。相反，下调的代谢物包括：Lys-Leu、Pro-Phe、Pro-Leu、Pro-Gln、甲基酪氨酸酯、Pro-Ser、Arg-Leu、Phe-Ile、Lys-Val、His-Lys、DL-Leu-DL-Val、Met-Pro-Lys和Asp-Leu-Lys。阴性离子模式下，显著上调的代谢物包括：α-羟基-3-氧代-4-胆甾酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、N-乙酰-D-半乳糖胺醇和D-果糖-6-磷酸。同时，下调的代谢物包括：Trp-Leu、Trp-Val、Thr-Val-Leu、Val-Gly-Val、Pro-Ala、Thr-Leu、Val-Glu、Glu-Arg、Val-Ile和Ile-Thr。

这些结果表明胰腺癌组织(T)与癌旁组织(N)相比，氨基酸代谢存在显著差异。

KEGG分析确定了几个在胰腺癌中起重要作用的代谢途径：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、核苷酸代谢、泛酸和CoA生物合成、氨基酸生物合成、ABC转运蛋白、代谢途径、蛋白质消化和吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、胆固醇代谢、胰岛素抵抗、癌症中的胆碱代谢、D-氨基酸代谢、胆汁分泌、β-丙氨酸代谢、初级胆汁酸生物合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。MetPA分析强调了最相关的代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成以及不饱和脂肪酸的生物合成。MSEA分析作为KEGG分析的补充模式，进一步确定了高度相关的途径，如：神经活性配体受体相互作用、硫代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、嘧啶代谢、亚油酸代谢、核苷糖生物合成、初级胆汁酸生物合成、半乳糖代谢、代谢途径、组氨酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成。因此，研究人员将重点关注氨基酸代谢，特别是参与谷氨酰胺代谢途径的谷氨酸代谢及其中间产物。

显著差异的肿瘤内微生物群与显著差异代谢物之间的相互作用

16S测序数据与代谢组学之间的关联分析主要利用统计算法来识别差异丰富的肿瘤内微生物群与代谢物之间的显著相关性。Spearman相关性分析揭示了差异丰富的微生物群与代谢物之间以及代谢物内部和肿瘤内微生物群内部的显著相关性。

Spearman和Mantel检验相关网络图显示，假单胞菌可能通过下调代谢物如α-酮异戊酸（缬氨酸的代谢中间体，一种支链氨基酸[BCAA]）、16-羟基十六烷酸和肉豆蔻酸来负向调节肿瘤进展。相反，假单胞菌可能通过上调代谢物如乙酰肉碱、壬酸和三聚氰胺来促进肿瘤进展。代谢组和微生物组的联合分析突出了氨基酸代谢在胰腺癌中的突出作用。因此，假单胞菌、氨基酸及其中间代谢物之间的相互作用可能调节胰腺癌的发生和发展。

假单胞菌差异丰度的临床意义

研究发现胰腺癌中α多样性（ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数）与分期（I、II和III期）之间没有显著相关性。同样，假单胞菌的相对丰度与T分期、N分期或临床分期之间也没有显著相关性。癌症微生物数据库（TCMbio）的总生存期（OS）分析显示，较高水平的假单胞菌与胰腺癌患者较短的总生存期（OS，P=0.049）和无病间隔期（DFI）相关。

Kaplan-Meier曲线显示，胰腺癌中的假单胞菌与我们队列中降低的总生存期相关（log-rank P=0.037）。

本研究通过微生物组分析发现胰腺癌组织中优势肿瘤内微生物为假单胞菌，代谢组学分析则发现氨基酸代谢特别是参与谷氨酰胺代谢途径的谷氨酸代谢存在显著改变。多组学相关性分析进一步证明了假单胞菌与氨基酸代谢途径（包括支链氨基酸缬氨酸的代谢产物α-酮异戊酸）之间的强关联，表明这种相互作用可能是胰腺癌微环境中的关键调控机制。

研究结果不仅揭示了胰腺癌微环境中的特定调控机制（即假单胞菌的富集及其与氨基酸代谢途径的显著相关性），还拓展了微生物-代谢相互作用研究的前沿。具体而言，氨基酸代谢的差异是胰腺癌代谢重编程的关键特征，假单胞菌的高丰度可能通过调节特定氨基酸代谢途径影响肿瘤细胞生长和侵袭潜力。

从临床角度来看，本研究结果为胰腺癌的诊断和治疗提供了几个潜在应用方向：一是发现潜在的诊断和治疗靶点：假单胞菌的丰度及其对氨基酸代谢物（如谷氨酰胺和支链氨基酸代谢物）的调控可能作为胰腺癌潜在的诊断和预后生物标志物；二是术后复发监测和预后评估：假单胞菌及其相关代谢物可作为监测胰腺癌术后复发的动态生物标志物；三是促进精准医疗发展：胰腺癌患者微生物和代谢物谱的异质性为个性化治疗策略提供了基础。

本研究也存在一些局限性：样本量相对较小，特别是16S测序样本量的减少可能限制全面捕捉胰腺癌患者微生物组和代谢组的多样性和异质性；缺乏IV期（M1）患者样本；基于16S rDNA测序的微生物组分析可能存在偏差；当前数据表明肿瘤内假单胞菌物种与氨基酸（BCAA）代谢重编程之间存在潜在关联，但因果关系尚不明确；样本处理或实验变异引入的偏差等。这些局限性突出了未来研究中需要改进的领域。扩大样本量（包括所有临床分期）、整合多组学数据、进行机制验证实验以及解决样本处理和实验偏差问题，将增强这些发现的科学理解和临床适用性。

综上所述，本研究初步证明了假单胞菌与氨基酸在胰腺癌微环境中的相互作用，表明其调控可能存在潜在关联，提出了"微生物-代谢-癌症"机制的新理论框架，增强了我们对胰腺癌发病机制的理解。然而，因果关系和潜在机制尚未通过实验探索，需要进一步验证。这些发现突出了未来探索胰腺癌诊断和治疗意义的研究可能性，但并未建立直接应用于早期诊断、个性化治疗或改善预后的方法。