环状RNA hsa_circ_0038737通过IGF2BP3介导的DNPH1 mRNA稳定机制促进去势抵抗性前列腺癌PARP抑制剂耐药性研究

　　本研究针对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中PARP抑制剂（PARPi）耐药性难题，揭示了hsa_circ_0038737通过结合RNA结合蛋白IGF2BP3稳定DNPH1 mRNA的表达，增强DNA损伤修复能力，从而介导PARPi耐药。该发现为克服CRPC治疗阻力提供了新的生物标志物和治疗靶点。

　　

前列腺癌是全球男性第二常见的恶性肿瘤，而去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是其进展的晚期阶段，尽管采取了雄激素剥夺治疗，疾病仍会继续发展。几乎所有前列腺癌相关的死亡都归因于CRPC，尤其是转移性CRPC（mCRPC）。流行病学数据显示，CRPC占所有前列腺癌病例的10%-20%，一旦发生转移，患者的中位生存期不足三年。

大约28%的mCRPC患者携带同源重组修复（HRR）基因（如BRCA1/2）突变，这使得他们成为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（PARPi）的候选治疗对象。PARPi（如奥拉帕尼和鲁卡帕尼）利用合成致死原理，靶向HRR缺陷的肿瘤，导致DNA损伤积累和细胞死亡。然而，PARPi的临床疗效常常因耐药性的出现而受限，这成为CRPC治疗中的重大挑战。耐药机制包括BRCA基因的回复突变、药物外排泵的上调以及DNA修复途径的改变。理解这些耐药机制对于制定克服治疗限制和改善患者预后的策略至关重要。

环状RNA（circRNA）因其独特的环状结构和功能多样性，已成为肿瘤发生和癌症进展的关键调控因子。与线性RNA不同，circRNA高度稳定且不易降解，使其能够通过与RNA结合蛋白（RBP）和microRNA的相互作用来调控基因表达。在前列腺癌中，circRNA参与调控细胞增殖、凋亡和耐药性等关键通路。例如，METTL3通过m⁶A修饰增强CircGLIS3的稳定性，而CircGLIS3通过隔离miR-661上调MDM2 mRNA水平，从而调控p53信号通路，促进前列腺癌的增殖、迁移和侵袭。此外，circ_0004087与转录共激活因子SND1相互作用，刺激MYB的转录激活，增强其下游靶点BUB1的表达，进而促进有丝分裂并增加前列腺癌对多西他赛的耐药性。这些发现强调了circRNA作为前列腺癌生物标志物和治疗靶点的潜力。

本研究旨在阐明hsa_circ_0038737通过转录后调控途径调节CRPC中PARPi耐药性的分子机制。研究人员采用了一套全面的体外和体内方法，包括qRT-PCR、RNA测序、RNA-蛋白质pull-down、RNA免疫沉淀、功能测定以及异种移植/类器官模型，以研究hsa_circ_0038737在CRPC进展和治疗反应中的生物学功能和机制作用。

研究发现，hsa_circ_0038737是一种核富集的circRNA，在CRPC中显著上调，其表达水平与不良预后和侵袭性临床特征相关。机制上，hsa_circ_0038737与RNA结合蛋白（RBP）IGF2BP3相互作用，增强DNPH1 mRNA的稳定性，后者是一种对DNA修复至关重要的核苷酸清理酶。circRNA-RBP-mRNA调控轴通过促进DNA损伤修复能力来增强PARPi耐药性。此外，研究还揭示了反向互补Alu元件介导circRNA的生物发生，而HNRNPDL促进了这一过程。DNPH1的药理学抑制在体外和体内均有效恢复了PARPi敏感性。

这些发现揭示了一个新的hsa_circ_0038737/IGF2BP3/DNPH1轴，该轴驱动CRPC中的PARPi耐药性，为克服耐药性和改善晚期前列腺癌治疗结果提供了有潜力的生物标志物和治疗靶点。

主要技术方法

研究使用了78对CRPC组织样本和5个前列腺癌细胞系，通过qRT-PCR、RNA测序、RNA-蛋白质pull-down、RNA免疫沉淀、功能实验（如CCK-8、克隆形成、细胞周期分析）、异种移植模型和患者来源类器官（PDO）模型，结合生物信息学分析（GO、KEGG、WikiPathways富集分析）和临床数据验证（来自cBioPortal的MSKCC和SU2C队列）。

研究结果

Hsa_circ_0038737在PCa组织中上调并与PCa的侵袭性进展相关

分析五个独立的公开转录组数据集发现，hsa_circ_0038737在PCa组织中 consistently且显著上调。qRT-PCR验证了其在78对临床PCa样本中的表达，并通过Sanger测序确认了其反向剪接连接。基因组比对表明，hsa_circ_0038737由GTF3C1基因的35和36外显子通过经典的反向剪接机制生成。功能实验显示，hsa_circ_0038737具有增强的稳定性，其半衰期较其线性对应物GTF3C1 mRNA更长，且对RNase R消化表现出明显的抗性。亚细胞分离和FISH实验表明，hsa_circ_0038737主要位于细胞核中。表达分析显示，其在恶性细胞中的表达水平显著高于正常前列腺上皮细胞系RWPE-1，且在肿瘤组织中显著上调，表达水平与晚期T分期和更高的Gleason评分呈正相关。

Hsa_circ_0038737通过促进G2/M细胞周期进程增强PCa细胞的增殖

通过建立hsa_circ_0038737的功能获得和功能缺失模型，研究发现其敲低显著抑制细胞增殖，而过表达则增强克隆形成能力。细胞周期分析显示，敲低hsa_circ_0038737导致G2期细胞积累，而过表达减少G2期群体，表明其可能通过加速G2到M期的转变来调控肿瘤生长。

Hsa_circ_0038737通过KH结构域直接与IGF2BP3相互作用以介导前列腺癌中的功能活性

通过生物素化RNA pull-down assay结合质谱分析，发现IGF2BP3是hsa_circ_0038737的主要相互作用蛋白。GO、KEGG和WikiPathways富集分析表明，这些蛋白与mRNA结合、mRNA稳定和RNA代谢通路显著相关。RNA-FISH和免疫荧光染色证实了hsa_circ_0038737与IGF2BP3在细胞核中的共定位。RNA pull-down和RIP实验进一步验证了它们的物理结合，且相互作用主要通过IGF2BP3的KH1和KH2结构域介导。

IGF2BP3作为增殖驱动因子和前列腺癌不良预后的指标

功能实验表明，IGF2BP3敲低抑制细胞增殖，而过表达增强增殖能力。生存分析显示，高IGF2BP3表达与较短的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著相关。虽然hsa_circ_0038737的表达变化不影响IGF2BP3蛋白水平，但研究表明hsa_circ_0038737可能作为分子支架，促进IGF2BP3介导的特定靶标mRNA的稳定。

Hsa_circ_0038737-IGF2BP3复合物稳定DNPH1 mRNA以促进DNA损伤反应信号传导

RNA-seq分析发现，hsa_circ_0038737敲低导致314个基因下调和101个基因上调。GO富集分析显示这些基因与mRNA稳定性调控和DNA损伤反应通路相关。通路分析一致强调DNA修复、DNA损伤检查点信号传导和基因组稳定性维护是受影响最显著的生物学过程。通过整合RNA-seq数据、IGF2BP3 CLIP-seq数据和StarBase预测，将DNPH1确定为高可信度靶标。RIP实验证实了IGF2BP3与DNPH1 mRNA的直接结合。功能上，hsa_circ_0038737敲低降低DNPH1 mRNA水平，而过表达增加其丰度。IGF2BP3敲低降低DNPH1蛋白表达，而过表达提高其水平。mRNA衰减实验表明，敲低hsa_circ_0038737或IGF2BP3显著缩短DNPH1 mRNA的半衰期。

DNPH1增强增殖并赋予CRPC细胞对PARP抑制剂的耐药性

功能实验显示，DNPH1过表达增强细胞增殖和克隆形成能力，而敲低抑制肿瘤细胞生长。生存分析表明，高DNPH1表达与较差的OS和DFS显著相关。IC₅₀实验表明，DNPH1敲低增加对奥拉帕尼和尼拉帕尼的敏感性，而过表达则赋予耐药性。彗星实验显示，DNPH1耗竭增加DNA链断裂，而过表达减少DNA损伤。药理学抑制DNPH1使用N6-苄基腺苷模拟了基因敲低的效果，导致DNA损伤积累增加。

Hsa_circ_0038737通过DNPH1依赖性机制诱导PARP抑制剂耐药

IC₅₀实验显示，hsa_circ_0038737敲低增强对PARPi的敏感性，而过表达则赋予耐药性。联合DNPH1抑制剂（DNPH1i）处理可逆转由hsa_circ_0038737过表达诱导的PARPi耐药性。彗星实验和γ-H2AX免疫荧光染色表明，hsa_circ_0038737敲低增加DNA损伤，而过表达减少DNA损伤积累；DNPH1i处理在hsa_circ_0038737过表达细胞中恢复DNA损伤水平。在circRNA过表达细胞中，联合DNPH1i/PARPi处理显著增加PARP1在染色质结合部分的保留，模拟了PARPi单药治疗在circRNA敲低细胞中的效果。PLA分析显示，在circRNA过表达细胞中经DNPH1i+PARPi处理以及circRNA耗竭细胞中接受PARPi单药治疗后，γ-H2AX/PARP1共定位焦点显著增加。

BRCA突变增强DNPH1i介导的PARPi耐药细胞中的细胞毒性

在BRCA1和BRCA2敲低模型中，Western blot分析显示DNPH1蛋白表达未改变，表明DNPH1调控独立于BRCA状态。功能上，在BRCA1和BRCA2缺陷模型中，联合PARPi和DNPH1i处理显著增强对细胞增殖的抑制 compared to PARPi单药治疗。

Hsa_circ_0038737在体内促进肿瘤生长并通过DNPH1介导PARP抑制剂耐药

异种移植模型显示，hsa_circ_0038737过表达加速肿瘤进展，而敲低抑制肿瘤生长。过表达肿瘤对奥拉帕尼耐药，而联合DNPH1i处理恢复药物敏感性。IHC染色显示，过表达组肿瘤中DNPH1和Ki-67水平升高，而敲低组中这些标志物表达显著降低。临床样本分析显示，IGF2BP3与DNPH1表达呈强正相关。患者来源类器官（PDO）实验证实，来自高hsa_circ_0038737表达肿瘤的类器官对奥拉帕尼耐药，但经DNPH1i联合处理后耐药性显著逆转。

Alu元件和HNRNPDL协同介导hsa_circ_0038737的环化和生物发生

基因组分析发现，hsa_circ_0038737侧翼内含子区域存在两个高度互补的Alu重复（AluSp和AluSq2）。迷你基因实验表明，删除任一Alu元件均显著损害circRNA形成。RBPmap预测HNRNPDL为同时结合AluSp和AluSq2的候选RBP。功能实验显示，HNRNPDL敲低显著降低hsa_circ_0038737表达，且DNPH1表达也下调。多个前列腺癌队列的RNA-seq数据显示，HNRNPDL与DNPH1 mRNA水平呈显著正相关。

结论与讨论

本研究揭示了hsa_circ_0038737通过形成与IGF2BP3的功能性复合物来稳定DNPH1 mRNA，从而增强DNA修复能力并促进PARP抑制剂耐药性的新机制。hsa_circ_0038737的生物发生受Alu元件介导的环化和RNA结合蛋白HNRNPDL的严格控制。重要的是，DNPH1的药理学抑制可有效逆转hsa_circ_0038737诱导的PARPi耐药性。这些发现揭示了一个新的circRNA/RBP介导的调控轴——hsa_circ_0038737/IGF2BP3/DNPH1，该轴促进CRPC进展和治疗耐药性，为联合治疗策略提供了新的见解，并确定了克服PARPi耐药性的潜在组合治疗策略。

研究的局限性包括临床组织和类器官的样本量较小，需要在更大队列中验证。此外，hsa_circ_0038737在其他癌症类型中的功能作用及其作为癌症进展通用生物标志物的潜力有待未来研究探索。空间转录组学和单细胞测序的进展可进一步解析肿瘤微环境中circRNA表达的异质性，提供背景依赖性耐药机制的见解。最后，虽然DNPH1抑制剂在临床前模型中显示有效性，但其在人体中的药代动力学和安全性特征需要进一步评估。这些局限性并不削弱核心发现，但突出了未来研究的方向。

总之，该研究为克服CRPC中PARPi耐药性提供了新的分子见解和治疗策略，强调了靶向circRNA-蛋白质相互作用在改善晚期前列腺癌治疗结果中的潜力。