流式细胞术与荧光显微镜在评估生物活性玻璃细胞毒性中的性能对比研究：揭示颗粒尺寸与浓度依赖性效应

　　为解决颗粒生物材料细胞毒性评估中荧光显微镜(FM)与流式细胞术(FCM)方法学性能不明的问题，研究人员开展了针对45S5生物活性玻璃(BG)诱导SAOS-2成骨细胞毒性的对比研究。结果表明FCM在灵敏度、统计分辨率和细胞死亡亚群区分方面优于FM，两者强相关(r=0.94)，证实FCM是颗粒生物材料相容性评价的可靠定量工具。

　　

在生物材料研发领域，准确评估材料细胞毒性是 preclinical 评价的关键环节。荧光显微镜(FM)和流式细胞术(FCM)作为两种广泛应用的细胞活力检测技术，在颗粒生物材料体系中的性能对比却缺乏系统研究。生物活性玻璃(Bioglass 45S5, BG)作为典型的骨修复材料，其溶解过程中会释放Na⁺和Ca²⁺离子导致局部pH升高，产生剂量依赖的细胞毒性效应，这使其成为研究颗粒材料细胞毒性效应的理想模型。然而，由于BG颗粒自身可能产生自发荧光和光散射效应，会干扰荧光成像的准确性，而传统显微镜方法又存在采样偏差和通量低的问题。因此，系统比较FM与FCM在颗粒生物材料毒性评估中的性能差异，对建立标准化、可靠的生物相容性评价方法具有重要意义。

本研究通过让SAOS-2成骨样细胞接触不同尺寸(<38μm、63–125μm和315–500μm)和浓度(25、50和100 mg/mL)的BG颗粒，分别采用FDA/PI荧光染色显微镜检测和多参数荧光染色(Hoechst、DilC1、Annexin V-FITC和PI)流式细胞分析，对比两种方法在3小时和72小时时间点检测细胞活力的能力，旨在明确哪种方法能更灵敏、准确地捕捉生物玻璃引起的细胞毒性响应。

研究采用的关键技术方法包括：熔融淬火法制备BG 45S5并筛分不同粒径颗粒；SAOS-2细胞培养与BG颗粒共孵育；pH计监测培养基酸碱变化；荧光显微镜进行FDA/PI活死染色与图像分析；多色流式细胞术检测细胞活性、凋亡和坏死群体。实验设三重复，数据以均值±标准差表示，采用双因素方差分析(ANOVA)进行统计检验。

pH variations

BG颗粒引起的培养基pH变化呈现明显的尺寸和浓度依赖性：颗粒越小、浓度越高，pH值上升越显著。处理3小时后，<38μm颗粒在100 mg/mL浓度下pH达到9.40±0.2，而对照组为7.45±0.1。所有尺寸的颗粒在较高浓度下均显著提高pH（p<0.0001）。72小时后pH升高幅度有所减缓，但仍保持相同趋势，说明BG的离子交换活性持续影响培养基化学环境。

Fluorescence microscopy outcomes

FM结果显示，细胞存活率随BG颗粒尺寸减小和浓度增加而显著降低。3小时处理组中，<38μm颗粒在100 mg/mL下存活率降至9.8±6.8%，而315–500μm组在同等浓度下为18.7±5.8%。72小时后细胞存活情况略有恢复，但小颗粒高浓度组仍显示较强毒性。荧光图像直观展示了存活细胞（绿色）和死亡细胞（红色）的形态变化，证实颗粒尺寸和剂量对细胞状态的影响。

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Flow cytometry outcomes

流式细胞术通过多参数设门策略有效去除了碎片和BG颗粒干扰，精准识别出完整细胞群体。FCM不仅定量评估细胞存活率，还区分出早期凋亡（Annexin V-FITC阳性/PI阴性）、晚期凋亡（Annexin V-FITC阳性/PI阳性）和坏死（PI阳性）细胞亚群。在3小时时间点，<38μm颗粒在100 mg/mL下存活细胞仅占0.2%，而对照组高达97.5%。FCM进一步揭示，高浓度小颗粒主要引起坏死性死亡，而大颗粒组则可见更多凋亡细胞。

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Comparative analysis

FM与FCM测得的细胞存活率高度相关（r=0.94, R2=0.8879, p<0.0001），尤其在中等至高存活率区间一致性良好。但在低存活率条件下（<20%），FCM表现出更优的精确度和可靠性，变异系数(CV)低于FM。对照组中FCM的CV仅为0.1–0.5%，而FM为0.9–2.3%，说明FCM在定量方面更具优势。

研究

研究结论表明，BG的细胞毒性具有明显的尺寸和浓度依赖性，小颗粒和高浓度导致更显著的毒性效应，主要通过坏死途径引起细胞死亡。流式细胞术凭借其高分辨率、多参数分析和定量可靠性，在评估颗粒生物材料细胞相容性方面优于荧光显微镜，特别适用于高细胞毒性条件下的精准检测。该研究不仅证实了生物活性玻璃的生物学效应机制，也为生物材料领域的标准化毒性评价提供了方法学依据，推荐在未来的颗粒生物材料研究中优先采用FCM并结合多种正交方法进行验证，以获取更全面的细胞反应信息。论文研究成果发表于《BioMedical Engineering OnLine》，为生物材料细胞毒性评估提供了扎实的实验数据和理论支持。