单细胞钙信号图谱揭示癌细胞异质性：机器学习驱动的功能表征与表型预测新策略

　　为解决癌细胞功能异质性表征难题，本研究结合单细胞钙成像与机器学习，建立了27,439个钙响应图谱的无监督聚类模型，成功定义26种钙信号特征簇。通过神经网络实现了单细胞水平耐药性（如多西他赛耐药）和细胞类型（癌细胞/成纤维细胞）的精准预测，为癌症功能分型提供了动态评估新范式。

　　

钙离子（Ca²⁺）作为关键第二信使，通过时空振荡模式（即钙信号签名）调控细胞增殖、迁移和化疗抵抗等致癌功能。尽管测序技术揭示了肿瘤基因组异质性，但功能层面的动态表征仍存在空白。尤其钙信号工具包（ion channels, pumps, exchangers）在癌症中呈现异质性失调，如何将分子表达转化为功能信号特征成为关键科学问题。

研究人员通过整合单细胞钙成像与机器学习算法，对16种前列腺癌和结直肠癌细胞系的27,439个激动剂诱导钙响应进行分析。利用图论无监督聚类识别出26种钙响应模式，构建了癌细胞特异性钙信号签名。平行开发的神经网络模型成功实现单细胞水平的耐药性判定和细胞类型区分，证实钙信号可作为表型预测的功能生物标志物。

本研究主要采用以下技术方法：1) 16种前列腺/结直肠癌细胞系模型（含非癌组织、原发灶和转移灶来源）；2) 8种激动剂（ATP、LPA、Ach、PAF、EGF、PGE2、Histamine）刺激的单细胞钙成像；3) 基于图论共享近邻网络（SNN）和Louvain算法的无监督聚类；4) 三层人工神经网络（ANN）的监督学习预测模型；5) 癌症基因组图谱（TCGA）和DepMap数据库的转录组验证。

Unsupervised clustering of heterogeneous agonist-induced Ca²⁺ responses identified Ca²⁺ signature of cancer cell lines

通过模拟单细胞转录组分析流程，对标准化钙信号进行主成分降维和共享近邻网络构建，鉴定出26个聚类可进一步划分为5个功能组：A/B组为非响应细胞，C组显示基底钙水平改变，D组特征为响应延迟，E组包含振幅最高且振荡频繁的细胞。钙信号签名分析表明，虽然癌症类型（前列腺癌vs结直肠癌）或起源部位（原发vs转移）未呈现显著差异，但遗传背景相似的细胞系（如LNCap与C4-2系列）显示高度相似的签名模式。

The agonist-induced Ca²⁺ response of a single cell is predictive of its phenotype

监督学习模型对单细胞钙响应的预测性能显示：癌症类型分类的F1-score达0.81（AUROC≈0.9），ATP和Thapsigargin诱导的响应具有最高预测权重。首次证实可通过钙信号区分上皮-间质转化（EMT）评分和分离部位（原发/转移），但对训练集外细胞系的预测性能下降，提示模型需进一步扩展样本多样性。

Acquired chemoresistance induces a remodeling of Ca²⁺ signature

多西他赛耐药模型（22RV1R、PC3R_High、PC3R_Low）的钙签名出现显著重编程。高耐药株（PC3R_High）的Wasserstein距离表明签名显著改变（p<0.01），而低耐药株（PC3R_Low）与亲本细胞相似。神经网络对耐药细胞识别的F1-score为0.72，但对中度耐药细胞的预测存在局限，反映钙信号重塑与耐药程度相关。

The interaction of cancer cells with the microenvironment induces a remodeling of Ca²⁺ signature

癌细胞与成纤维细胞（PF179T）共培养72小时后，ANN模型仍能以0.83的F1-score区分两类细胞。但共培养条件降低了对癌细胞识别的召回率（recall），且PC3细胞的钙签名出现显著改变，证明肿瘤微环境通过功能性钙信号重编程影响癌细胞表型。

本研究开创性地将钙信号分析提升至单细胞功能分型层面。无监督聚类提供的钙签名框架克服了传统描述符的主观性，而神经网络预测模型证实钙振荡模式携带细胞身份信息。尽管当前模型对未知样本的泛化能力有待提升，但该方法为肿瘤功能异质性研究提供了超越基因组/转录组的动态视角，尤其为微环境互作、耐药性演化等过程提供了实时观测窗口。未来结合空间转录组与体内钙成像，有望实现肿瘤组织功能图谱的构建，推动靶向钙信号网络的精准治疗策略。