RSL3通过双重机制调控PARP1介导的铁死亡-凋亡交叉对话并克服PARPi耐药性

　　本研究针对经典铁死亡诱导剂RSL3在诱导细胞死亡过程中存在凋亡机制不明的科学问题，开展了RSL3调控PARP1介导的铁死亡-凋亡交叉对话机制研究。研究人员发现RSL3通过升高活性氧(ROS)水平，一方面激活caspase-3导致PARP1酶切激活凋亡通路，另一方面通过抑制METTL3介导的m6A修饰减少全长PARP1翻译，引发DNA损伤依赖性凋亡。重要的是，RSL3在PARP抑制剂(PARPi)耐药细胞中仍保持促凋亡功能，能有效抑制PARPi耐药肿瘤的体内生长，为克服PARPi耐药提供了新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，程序性细胞死亡方式的调控一直是研究热点。铁死亡(ferroptosis)作为一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，与传统的细胞凋亡(apoptosis)在生化特征和分子机制上存在本质区别。铁死亡主要表现为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)降解导致的脂质过氧化，而凋亡则通过线粒体外膜通透化(MOMP)触发细胞色素c(CytC)释放和caspase蛋白酶级联反应。近年来研究发现，某些铁死亡诱导剂能够同时触发这两种死亡途径，形成协同抗肿瘤效应，但其背后的分子桥梁和调控机制尚不明确。

RSL3作为经典铁死亡诱导剂，主要通过靶向GPX4触发铁死亡。然而越来越多的证据表明，RSL3还具有显著的促凋亡活性，特别是在髓系异常增生综合征细胞中能够通过ROS介导的机制诱导凋亡。这种双重细胞死亡诱导能力使其成为研究铁死亡-凋亡交叉对话的理想工具。与此同时，聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)作为DNA损伤应答(DDR)的关键决定因子，在细胞命运抉择中扮演着重要角色。PARP1不仅能够被caspase-3和caspase-7切割产生促凋亡片段，其缺失还会加剧DNA损伤并促进凋亡。这种功能双重性表明PARP1可能作为铁死亡和凋亡信号整合的分子节点。

尽管PARP抑制剂(PARPi)在BRCA突变癌症中取得临床成功，但获得性耐药仍然是主要治疗障碍。传统策略难以克服这种耐药性，迫切需要替代方法来重新激活PARPi耐药肿瘤中的凋亡过程。基于m⁶A修饰在DNA损伤应答和铁死亡中的调控作用，研究人员推测RSL3可能通过PARP1介导的表观转录组控制和caspase信号传导的汇聚来协调铁死亡和凋亡。

为验证这一假设，研究人员开展了一系列实验。他们采用MTT法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡和周期分布，Western blot检测蛋白表达水平，m⁶A RNA免疫沉淀(MeRIP)-qPCR分析m⁶A修饰水平，RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR鉴定PARP1 m⁶A位点的靶蛋白，同时建立PARPi耐药细胞的小鼠异种移植模型分析RSL3对耐药肿瘤生长的抑制作用。研究使用了包括肝癌、骨肉瘤、结直肠癌和乳腺癌在内的多种肿瘤细胞系，以及来自患者样本的PARPi敏感和耐药细胞模型。

RSL3通过促进PARP1切割诱导caspase依赖性凋亡

研究人员首先评估了RSL3对多种肿瘤细胞系的杀伤效果，发现不同组织学类型的癌细胞对RSL3均表现出敏感性，但IC₅₀值存在差异(0.34μM至超过10μM)。在高于IC₅₀浓度的RSL3处理下，多种癌细胞中cleaved caspase-3和PARP1片段水平显著增加，而总蛋白水平降低。流式细胞术分析证实RSL3处理使细胞凋亡率显著升高(7.25%至23.4%)。使用pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK能够有效抑制RSL3诱导的PARP1切割和凋亡，证明RSL3通过caspase依赖性机制促进PARP1切割诱导凋亡。值得注意的是，Z-VAD-FMK不能挽救RSL3诱导的全长PARP1减少，提示还存在其他机制。

RSL3通过减少全长PARP1引发DNA损伤依赖性凋亡

鉴于RSL3能够诱导细胞周期阻滞并激活DNA损伤检查点，研究人员探索了RSL3是否通过全长PARP1触发DNA损伤依赖性凋亡。免疫荧光显示RSL3处理显著增加γH2AX焦点(DNA双链断裂标志物)和γH2AX蛋白水平。彗星实验进一步证实RSL3处理导致更长的彗星尾矩。RSL3还显著上调p53表达(DNA损伤应答关键调节因子)，同时降低细胞周期检查点调节因子CDK2、CyclinD1、CDK4和p-Rb/Rb以及DNA修复因子PARP1的水平。过表达PARP1能够有效抵消RSL3诱导的效应，恢复CDK2、CyclinD1、CDK4和p-Rb/Rb水平，同时减少γH2AX。细胞周期和凋亡分析表明PARP1过表达显著减轻RSL3诱导的S期阻滞和凋亡，证明PARP1在介导RSL3诱导的DNA损伤依赖性凋亡中起关键作用。

RSL3通过METTL3-YTHDF1通路减少PARP1 m⁶A修饰

为阐明RSL3降低全长PARP1水平的机制，研究人员排除了自噬和蛋白酶体降解途径的可能性。意外的是，RT-qPCR显示RSL3处理反而显著上调PARP1转录本水平。基于m⁶A修饰对mRNA翻译、降解、剪接和核输出的调控作用，研究人员推测RSL3可能通过m⁶A调制损害PARP1翻译。生物信息学预测发现PARP1基因存在潜在的m⁶A位点(3496位点，靠近3'-UTR)。MeRIP-qPCR证实预测位点存在显著的m⁶A富集，而RSL3处理显著降低这种修饰。机制上，RSL3显著降低METTL3和YTHDF1在mRNA和蛋白水平的表达。RIP-qPCR验证YTHDF1蛋白与PARP1 mRNA的结合，而RSL3强烈抑制这种相互作用。METTL3过表达能够恢复PARP1 m⁶A富集和YTHDF1结合，表明RSL3通过减弱METTL3介导的PARP1 m⁶A修饰和YTHDF1结合来减少全长PARP1水平。

RSL3通过增强脂质过氧化抑制METTL3介导的PARP1蛋白翻译

鉴于METTL3-YTHDF1信号在蛋白翻译中的已知作用，研究人员发现RSL3抑制全局蛋白翻译活性，而野生型METTL3过表达能够挽救RSL3处理细胞的翻译效率。多聚核糖体-qPCR分析进一步证实METTL3过表达显著恢复被RSL3降低的PARP1翻译效率。RSL3处理增加细胞ROS水平，而抗氧化剂尿酸(UA)能够显著提高抗氧化能力并减少MDA(脂质过氧化标志物)。UA处理逆转RSL3对METTL3、YTHDF1、全长PARP1、caspase-3和GPX4蛋白水平的抑制作用，同时减弱RSL3诱导的caspase-3和PARP1切割，证明RSL3通过增加ROS水平抑制METTL3-YTHDF1通路，最终损害PARP1蛋白翻译。

抑制脂质过氧化减弱RSL3诱导的PARP1介导的caspase和DNA损伤依赖性凋亡

时间进程实验显示RSL3处理逐渐增加早期和晚期凋亡群体，同时诱导铁死亡群体先短暂增加后减少，表明RSL3诱导的铁死亡先于凋亡发生。使用铁抑制剂Fer-1或Lip-1预处理能够显著逆转RSL3诱导的PARP1和caspase-3切割、全长PARP1和METTL3-YTHDF1通路抑制以及γH2AX积累。Fer-1和Lip-1处理还减少γH2AX焦点形成和凋亡率，显著恢复细胞活力，确立脂质过氧化作为RSL3诱导的PARP1依赖性凋亡的关键介质。

RSL3在PARPi耐药细胞系中保持促凋亡功能

研究人员选择PARPi敏感细胞系(Kuromochi和HCC1395)和PARPi耐药细胞系(MDA-MB-453、MCF7和HCC1937)评估RSL3的促凋亡功能。细胞活力测定显示PARPi敏感细胞对RSL3高度敏感(IC₅₀<1μM)，而PARPi耐药细胞表现出相对耐药性(IC₅₀>4μM)，但这些浓度仍处于临床相关范围内。RSL3有效降低PARPi敏感和耐药细胞的活力，在PARPi耐药细胞中诱导时间依赖性凋亡。JC-1染色显示RSL3触发时间依赖性线粒体去极化。机制上，RSL3处理增加p53、CytC和cleaved caspase-3蛋白水平，同时降低全长caspase-3和PARP1，下调BCL2、BCL2L1和MYC mRNA而上调BAX mRNA，表明RSL3通过p53介导的CytC释放和caspase-3激活在PARPi耐药细胞中诱导凋亡。

RSL3抑制PARPi耐药细胞异种移植瘤体内生长

体内实验显示，Kuromochi来源的异种移植瘤对olaparib处理表现出明显敏感性，而MDA-MB-453、MCF7和HCC1937异种移植瘤表现出耐药性。相比之下，RSL3处理显著抑制PARPi敏感和耐药模型的肿瘤生长参数(大小、重量和体积)。重要的是，RSL3或PARPi处理均未引起显著体重减轻或器官毒性，表明在给药剂量下具有良好的耐受性。免疫组化分析显示RSL3处理显著降低细胞增殖(Ki67染色)，同时增加DNA损伤标志物(γH2AX染色)和凋亡(cleaved caspase-3染色)，证明RSL3在体内有效抑制PARPi耐药异种移植瘤的生长。

本研究揭示了RSL3通过ROS积累协调铁死亡和凋亡的双重机制，涉及caspase依赖性和DNA损伤依赖性凋亡途径。研究发现RSL3诱导的脂质过氧化驱动ROS生成，促进caspase-3激活和随后的PARP1切割，启动caspase依赖性凋亡。同时，RSL3诱导的ROS积累通过抑制METTL3-YTHDF1通路损害PARP1 m⁶A修饰，导致PARP1蛋白翻译破坏，进而引起γH2AX积累和严重DNA损伤诱导的凋亡。

这些发现具有重要的理论和实践意义。理论上，本研究首次将PARP1确立为铁死亡-凋亡交叉对话的双向调节因子，通过caspase依赖性切割和表观转录组调控两种截然不同的机制，为细胞死亡方式间的相互对话提供了新的分子框架。实践上，研究发现RSL3在PARPi耐药肿瘤中保持抗肿瘤功效，为克服临床PARPi耐药提供了有前景的治疗策略。通过同时靶向铁死亡和凋亡途径，RSL3可能为治疗凋亡难治性癌症提供新的治疗机会。

值得注意的是，RSL3对METTL3-YTHDF1通路的抑制作用可能是ROS介导的氧化应激的下游效应，而非铁死亡非依赖性途径。这种双重机制建立了在铁死亡期间凋亡执行的协同路线。然而，RSL3诱导的ROS积累导致METTL3-YTHDF1通路减少的具体机制仍需进一步研究，可能涉及SUMO化等翻译后修饰调控。

总之，本研究阐明了RSL3通过调控PARP1切割和全长形式在铁死亡期间诱导caspase和DNA损伤依赖性凋亡的先前未被认识的联系，为探索PARPi耐药机制和识别潜在联合治疗(如铁死亡激活剂)开辟了新途径，可能提高PARPi耐药癌症的治疗效果并使对当前策略无反应的患者受益。