肺上皮损伤通过重塑巨噬细胞功能削弱宿主对结核分枝杆菌的早期免疫应答

《Inflammation Research》：Lung epithelial injury impairs early host immune responses to Mycobacterium tuberculosis

　　本研究针对肺上皮屏障完整性如何影响结核分枝杆菌（Mtb）感染早期免疫应答这一关键问题，通过建立萘诱导的小鼠肺上皮损伤模型并结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，揭示了上皮损伤导致抗菌基因表达下调、巨噬细胞从固有免疫防御向抗原呈递表型转变的分子机制，为探索上皮-免疫交互作用作为结核病潜在治疗靶点提供了重要理论依据。

　　

结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的一种慢性传染病，至今仍是全球重大的公共卫生负担。据世界卫生组织2024年全球结核病报告，2023年全球约有1080万人罹患结核病，并导致约125万人死亡，使其成为全球单一传染源导致死亡的首要原因。结核分枝杆菌感染的临床结局呈现高度异质性，部分感染者能够完全清除病原体（称为“抵抗者”），部分会发展为具有高传染性的活动性结核病（Active Tuberculosis, ATB），还有相当一部分感染者则会进入潜伏性结核感染（Latent Tuberculosis Infection, LTBI）状态。在约占全球人口四分之一的LTBI人群中，预计有5-15%会在一生中发展为活动性结核病，这构成了结核病持续传播的重要基础。这种迥异的感染轨迹被认为源于宿主免疫失调以及复杂的宿主-病原体相互作用，然而，决定这些结局的具体细胞和分子机制尚未被完全阐明。

在宿主抗结核免疫中，巨噬细胞扮演着核心角色，它既是免疫哨兵细胞，也是结核分枝杆菌的主要细胞内寄生场所。感染发生后，巨噬细胞通过启动吞噬溶酶体融合、产生活性氧和活性氮物种等方式发起抗菌反应。同时，它们通过向T细胞呈递抗原来协调适应性免疫，而T细胞分泌的干扰素-γ（Interferon-gamma, IFN-γ）又能通过正反馈环路进一步强化巨噬细胞的活化。然而，结核分枝杆菌进化出多种免疫逃逸策略来规避巨噬细胞的杀菌机制，包括阻断吞噬体成熟、抵抗氧化应激以及重编程宿主信号通路。此外，通过在病灶内建立酸性炎症微环境，结核分枝杆菌能够调节巨噬细胞功能，削弱其抗菌活性并加剧组织损伤。总体而言，以巨噬细胞为主导的免疫反应在结核分枝杆菌感染的启动和进展中起着核心调控作用。

除了免疫细胞，肺上皮细胞作为宿主对结核分枝杆菌反应的关键参与者日益受到关注。传统上被视为被动物理屏障的上皮细胞，如今被发现具有免疫调节功能，包括通过模式识别受体（如Toll样受体, TLRs和NOD样受体）感知病原体、分泌抗菌肽（如人β-防御素-1, hBD-1和溶菌酶）以及通过铁调素（hepcidin）表达调节铁稳态。响应感染，肺上皮细胞还能迅速释放细胞因子（如IL-6, IL-8, TNF-α）和趋化因子（如CXCL5, CCL2），从而促进固有免疫细胞向感染部位募集，启动局部抗菌反应。重要的是，上皮细胞与免疫细胞进行双向通讯，共同参与固有免疫和适应性免疫。例如，肺上皮细胞通过主要组织相容性复合物I类分子（MHC-I）和MHC相关蛋白1（MR1）呈递抗原可激活CD8⁺T细胞产生IFN-γ，而与受感染巨噬细胞的交互作用则可放大IL-1β和I型干扰素信号。这些相互作用在结核分枝杆菌感染期间协调黏膜免疫反应和维持宿主稳态方面至关重要。

尽管对肺上皮在宿主防御中作用的兴趣日益增长，但对于上皮屏障完整性如何影响对结核分枝杆菌早期免疫反应的全面理解仍显不足。特别是在感染初始阶段，肺上皮损伤所带来的免疫后果仍知之甚少。在这项发表于《Inflammation Research》的研究中，研究人员建立了一种结合萘诱导肺上皮损伤与结核分枝杆菌感染的小鼠模型，并采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术描绘了肺免疫景观的重塑过程。他们发现，肺上皮功能紊乱会导致上皮免疫活性受损，并驱动巨噬细胞从固有免疫防御向适应性免疫激活的异质性转变，最终削弱了早期的病原体清除能力。这些发现凸显了肺上皮细胞在结核分枝杆菌感染期间协调免疫调节的关键作用，为探索上皮-免疫相互作用作为潜在治疗靶点提供了新的方向。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：建立了萘（250 mg/kg）诱导肺上皮损伤联合结核分枝杆菌H37Rv株尾静脉感染的小鼠模型；通过菌落形成单位（CFU）测定评估肺内细菌负荷；利用组织学（H&E和抗酸染色）和免疫荧光染色分析肺病理变化和上皮细胞亚型；采用RT-qPCR和Western blot检测细胞因子和蛋白表达水平；核心技术创新性地运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）对肺组织细胞进行全景式转录组分析，并辅以CellChat算法推断细胞间通讯网络；最后，通过体外RAW264.7巨噬细胞感染模型，使用重组蛋白（C3, C5, Gas6）刺激并结合ELISA和同步扩增检测（SAT）技术，对上皮-巨噬细胞互作机制进行了功能验证。

Mtb感染激活小鼠肺部促炎和抗菌程序

为了探究早期结核分枝杆菌感染期间肺部的细胞和分子变化，研究人员建立了小鼠感染模型，并在感染后第14天收集肺组织进行组织学染色和scRNA-seq分析。

H&E染色显示，与未感染的对照组相比，H37Rv感染组（H37Rv组）小鼠肺部出现显著的肺泡结构破坏和明显的炎症细胞浸润。抗酸染色证实结核分枝杆菌定位于炎症病灶内，表明感染引发了局部趋化性免疫反应。scRNA-seq共获得25,932个高质量细胞，经降维和聚类分析后，根据经典标记基因识别出四个主要细胞区室：上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和基质细胞。对免疫区室的进一步亚群分析揭示了多样的免疫细胞亚群，包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。CellChat分析显示，与对照组相比，H37Rv感染组中多个促炎通路信号活性增强，特别是与IFN-γ和IL-16相关的通路。与此一致的是，肺组织RT-qPCR分析显示促炎细胞因子（Ifng, Tnf, Il6, Il1b）的mRNA水平显著升高，而Hamp表达显著降低，表明炎症反应加剧和铁稳态改变。细胞间通讯定量分析揭示，尽管组间相互作用总数相对稳定，但H37Rv组中巨噬细胞与T细胞之间的信号强度显著增强，表明结核分枝杆菌感染促进了巨噬细胞来源的免疫调节信号，从而增强T细胞活化。特别是观察到从T细胞到巨噬细胞的IFN-γ信号增强，这与早期感染期间适应性免疫的协同放大相一致。这些结果表明，结核分枝杆菌感染引发了肺部的促炎性免疫反应，其特征是免疫细胞募集以及巨噬细胞等效应细胞的激活。

巨噬细胞在Mtb感染早期肺部免疫景观中占主导地位

为了进一步阐明结核分枝杆菌感染期间肺部免疫反应的细胞驱动因素，研究人员对scRNA-seq数据集中的免疫细胞亚群进行了深入分析。

1.5 and adjusted p-value<0.05). E Violin plots showing representative inflammation-related DEGs upregulated in macrophages. F Top 10 Gene Ontology Biological Process(GOBP) terms in macrophages.G Selected TB-related functional pathways significantly enriched in macrophages'>

感染后观察到免疫细胞显著扩增：H37Rv组中免疫细胞占所有肺细胞的86.18%，而对照组为73.40%，相对增加了12.78%。在该区室内，巨噬细胞的增加最为显著，相对于未感染对照组丰度增加了17.32%，表明针对结核分枝杆菌感染发生了强大的巨噬细胞募集和积聚。差异基因表达分析在所有细胞中鉴定出3981个显著差异表达基因（DEGs），其中上调基因2158个，下调基因1823个。特别是在巨噬细胞中，214个基因上调，207个基因下调。值得注意的是，感染后巨噬细胞中多个促炎和抗菌基因表达上调，这些基因包括编码IL-1β的Il1b，以及介导T细胞、单核细胞和NK细胞募集的趋化因子Cxcl10, Ccl4和Ccl5。Camp, Ltf和Itgam的上调表明杀菌和吞噬功能增强，而Csflr表达升高则提示巨噬细胞增殖和存活增加。对214个巨噬细胞上调DEGs的基因本体生物学过程（GOBP）富集分析显示，与固有免疫调节、细菌防御、白细胞细胞毒性以及干扰素信号相关的通路被显著激活。对结核病相关GOBP条目的进一步分类凸显了在吞噬作用、自然杀伤（NK）细胞活化、TNF产生、粒细胞趋化以及铁离子转运调节等方面的富集，表明巨噬细胞抗菌程序被广谱激活。除巨噬细胞外，在其他细胞亚群（包括单核细胞、T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和内皮细胞）中也鉴定出超过200个DEGs，反映了广泛的免疫重塑。

Mtb感染增强上皮免疫反应的同时损害屏障完整性

鉴于观察到的结核分枝杆菌感染引起的组织破坏和炎症细胞浸润，研究人员接下来研究了感染对上皮屏障完整性及功能的影响。

免疫荧光染色定量分析肺组织切片中主要上皮亚型的数量。与对照组相比，克拉拉细胞（CYP2F2⁺）、纤毛细胞（TUBA1A⁺）或肺泡II型（AT2）细胞（SPC⁺）的数量未见显著差异。克拉拉细胞的关键分泌蛋白SCGB1A1的表达保持不变。然而，在H37Rv组中检测到杯状细胞（CLCA1⁺）显著增加，提示克拉拉细胞向杯状细胞的分化增强。这些结果表明，结核分枝杆菌感染驱动上皮细胞从稳态向免疫防御状态转变以应对病原体入侵。为了进一步探索感染期间上皮细胞的转录重编程，研究人员对scRNA-seq数据中的上皮细胞亚群进行了DEG分析。与对照组相比，H37Rv组上皮细胞表现出95个上调基因和235个下调基因。上调基因包括Lyz1和Lyz2（溶菌酶）、Slpi和Scgb1a1（屏障保护因子）以及Cxcl15（一种介导免疫细胞募集的趋化因子），表明黏膜防御功能增强。此外，表面活性物质相关基因Sftpd, Sftpb和Sftpa1显著升高，这可能有助于维持肺泡表面稳定性并增强病原体识别和清除。GOBP富集分析显示，上调基因显著富集于自噬调节和T细胞介导的细胞毒性等生物学过程，提示上皮细胞可能通过内在防御机制和协同免疫信号传导来促进微生物清除。相反，下调基因与细胞外基质组织、细胞-细胞粘附、血管生成和结构重塑相关，表明感染损害了上皮再生能力和结构完整性。进一步的功能分类强调，上调基因富集于免疫相关过程，包括固有免疫反应、防御细菌、对II型干扰素的反应、促进吞噬作用以及炎症调节。表面活性物质稳态通路的富集也提示了上皮细胞在应激下维持肺泡功能性的适应性反应。同时，下调基因显著参与与肺发育、肺泡形态发生、上皮迁移、紧密连接形成和屏障维持相关的过程，进一步表明感染可能损害上皮结构完整性并削弱肺的再生能力。总之，结核分枝杆菌感染与肺上皮细胞的转录变化相关，这可能反映了其对局部黏膜免疫反应的参与增强。

肺上皮损伤加剧早期细菌负荷

为了评估上皮损伤对宿主结核分枝杆菌免疫反应的影响，研究人员采用了双重损伤小鼠模型，即在用H37Rv感染之前，先用萘预处理小鼠以诱导肺上皮细胞损伤（Naph+H37Rv组）。

肺组织H&E染色显示，H37Rv组和Naph+H37Rv组均出现明显的肺泡破坏和炎症浸润。相比之下，单独萘处理组（Naph组）在损伤后第18天未导致显著的病理变化，表明此时上皮再生已基本完成。抗酸染色证实了两个感染组炎症病灶内均有结核分枝杆菌存在。肉芽肿区域量化显示，H37Rv组和Naph+H37Rv组之间受累肺组织百分比无显著差异。然而，通过CFU测定确定的细菌负荷在Naph+H37Rv组中显著更高，提示在先存在上皮损伤的情况下早期细菌清除能力受损。为了评估这种宿主反应改变的细胞基础，研究人员使用scRNA-seq比较了组间细胞类型分布。H37Rv组和Naph+H37Rv组之间肺细胞亚群的空间分布未见显著改变，Naph组和对照组之间也是如此，表明上皮损伤在此时间点并未明显影响肺细胞结构。CellChat分析显示，上皮损伤加剧了结核分枝杆菌感染期间的免疫信号改变。与H37Rv组相比，Naph+H37Rv组表现出多种免疫相关通路信号活性增强，包括CX3C、TNF，尤其是IFN-γ信号。这些变化在单独的Naph组中未观察到，证实了这些效应是感染特异性的，而非损伤诱导的。RT-qPCR分析支持这些发现，显示与H37Rv组相比，Naph+H37Rv组中Ifng和Tnf表达显著升高，但Il6和Il1b表达降低。在Naph组中，仅Hamp表达升高，表明存在铁稳态紊乱但无活动性炎症。进一步的细胞间通讯分析显示，与H37Rv组相比，Naph+H37Rv组细胞-细胞相互作用的数量和强度均增加，特别是在巨噬细胞-T细胞信号传导和巨噬细胞自分泌环路上。具体而言，从T细胞到巨噬细胞的IFN-γ配体输出显著增强，指向T细胞驱动的巨噬细胞活化水平升高。相比之下，在Naph组与对照组相比，上皮细胞-基质细胞/内皮细胞/巨噬细胞的通讯增加，这可能与上皮再生和修复有关。此过程似乎独立于IFN-γ信号调节。总之，这些发现表明，上皮损伤可能导致结核分枝杆菌清除受损，并与肺微环境中免疫异质性增加相关。

Mtb感染后恢复期肺上皮的转录组变化

为了进一步研究先前的上皮损伤如何影响早期结核分枝杆菌感染期间的屏障功能，研究人员分析了Naph+H37Rv组中上皮细胞再生和免疫能力。

1.5 and adjusted p-value<0.05).D Top 10 enriched GOBP terms from upregulated and downregulated DEGs in pulmonary epithelial cells. E Tuberculosis-related pathways in pulmonary epithelial cells'>

免疫荧光染色和定量分析显示，Naph+H37Rv组和H37Rv组之间克拉拉细胞（CYP2F2⁺）、纤毛细胞（TUBA1A⁺）、杯状细胞（CLCA1⁺）或肺泡II型（AT2）细胞（SPC⁺）的丰度无显著差异。克拉拉细胞的SCGB1A1分泌也未受影响。类似地，Naph组中的上皮细胞数量和分布与对照组相当，提示在损伤后第18天上皮再生已基本完成，且结核分枝杆菌感染并未损害此过程。然而，转录组分析揭示了上皮基因表达谱的显著改变。与H37Rv组相比，来自Naph+H37Rv组的上皮细胞表现出213个上调基因和128个下调基因。值得注意的是，几个关键的抗菌和免疫调节基因（Lyz2, Slpi, Cxcl15, Sftpd, Sftpb, Sftpa1）显著下调，提示上皮介导的病原体防御功能减弱。上调基因的GOBP富集分析显示，在与纤毛结构和运动性相关的通路中显著富集，这可能有助于黏液清除，但不直接贡献于细菌杀灭。相反，下调基因富集于与蛋白质折叠、胞质翻译和核糖体功能相关的通路，表明蛋白质合成和细胞稳态受损。对免疫相关生物学过程的进一步分析显示，下调基因参与抗菌防御、促进吞噬作用、IL-1介导的信号传导、成纤维细胞生长因子反应以及趋化因子介导的信号传导。这些变化反映了上皮对固有免疫和免疫细胞募集的贡献受损。此外，下调通路还包括那些调节上皮增殖和自噬的通路，提示再生能力和细胞内病原体清除能力也受到损害。总之，这些发现表明，虽然上皮结构和细胞类型组成在损伤后得以恢复，但其在免疫防御中的功能能力却显著降低。这些转录变化可能反映了早期感染期间上皮免疫能力的降低，潜在地限制了病原体清除并塑造了局部免疫反应。

上皮损伤影响Mtb感染期间巨噬细胞的免疫功能

为了阐明先前的上皮损伤如何影响结核分枝杆菌感染期间的免疫细胞功能，研究人员利用scRNA-seq数据集检查了免疫细胞反应。

1.5 and adjusted p-value<0.05).E Violin plots of representative DEGs in macrophages from the H37Rv and Naph+H37Rv groups.F Top 10 enriched GOBP terms from upreg-ulated and downregulated DEGs in macrophages. G Tuberculosis-related pathways in macrophages'>

虽然Naph+H37Rv组和H37Rv组之间的总体免疫细胞比例和空间分布相似，但在Naph+H37Rv组中观察到巨噬细胞丰度有适度增加（5.97%）。所有免疫细胞的差异基因表达分析鉴定出796个上调基因和827个下调基因，其中包括22个巨噬细胞特异上调基因和26个下调基因。在巨噬细胞内，促炎基因Il1b在Naph+H37Rv组中进一步上调，提示持续的炎症信号传导。值得注意的是，编码MHC分子的基因（H2-Aa, H2-Ab1, H2-Eb1 (MHC-II) 以及 H2-DMa, H2-DMb1 (MHC-I)）也显著上调，表明抗原呈递能力增强。相反，先前在单独结核分枝杆菌感染时上调的抗菌效应分子Camp和Ltf，在上皮损伤后表达下调。这些结果表明，巨噬细胞经历了功能重编程——从一种杀菌的、固有免疫主导的表型转变为以抗原呈递和适应性免疫激活为特征的表型。对Naph组（无结核分枝杆菌感染）的对照分析显示，与未损伤对照组相比，免疫细胞分布或基因表达无显著变化，证实了在Naph+H37Rv组中观察到的免疫重编程是上皮损伤与感染相互作用的特异性结果。为了探索这种转变的功能意义，对源自巨噬细胞的DEGs进行了GOBP富集分析。Naph+H37Rv组中的上调基因主要与抗原加工和呈递、T细胞活化以及适应性免疫调节相关。相反，下调基因主要与体液免疫反应、抗菌肽产生、核糖体生物发生和蛋白质翻译相关——这些是巨噬细胞固有免疫的标志。对结核病相关GOBP条目的分类进一步强化了这种二分法：上调基因与效应器活化和适应性免疫增强相关，而下调基因则映射到参与NK细胞分化、铁离子转运、促炎信号传导和体液抗菌防御的通路。总之，这些发现表明，上皮屏障损伤可能改变肺对结核分枝杆菌的免疫力，可能导致巨噬细胞从固有抗菌表型向抗原呈递导向表型的转录转变。

肺组织Western blot分析显示，与H37Rv组相比，Naph+H37Rv组中MHC-II蛋白水平升高。结合巨噬细胞DEG谱，这提示Naph+H37Rv组中巨噬细胞抗原呈递能力增强。为了进一步评估scRNA-seq分析预测的上皮-巨噬细胞相互作用的功能相关性，研究人员使用RAW264.7小鼠巨噬细胞进行了体外刺激和感染实验。用重组小鼠蛋白C3、C5或Gas6处理细胞，这些蛋白是上皮损伤后下调的上皮配体之一。ELISA检测显示，用C5刺激显著降低了巨噬细胞分泌IFN-γ和TNF-α，而用C3和Gas6处理导致轻微下降。这些发现表明C3、C5和Gas6对调节巨噬细胞炎症反应具有一定作用。此外，用C5刺激导致巨噬细胞分泌Camp呈上升趋势，表明C5可能通过上调抗菌肽水平来增强巨噬细胞抗菌功能。这些结果与体内肺免疫失调的转录组特征一致。为了直接评估细菌吞噬能力，研究人员用结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞，并使用同步扩增检测（SAT）法定量细胞内细菌rRNA水平。在用C3、C5和Gas6刺激后观察到的DT值降低可能反映了更高的初始rRNA丰度，这可能与细胞内细菌负荷增加的趋势一致。这些结果支持了一个模型，即上皮来源的信号调节巨噬细胞免疫功能，与体内观察到的转录转变一致。总之，这些发现提供了初步的功能证据，支持上皮来源的配体在早期结核分枝杆菌感染期间对巨噬细胞抗原呈递能力和抗菌能力的免疫调节作用。

结核分枝杆菌感染的临床结局是由宿主免疫防御与病原体介导的免疫调节之间的动态相互作用所塑造的。本研究结果揭示，上皮屏障完整性对于在结核分枝杆菌早期感染期间维持有效的宿主免疫力和限制病原体增殖至关重要。破坏此屏障不仅会削弱上皮的抗菌防御，还会改变巨噬细胞的功能状态——倾向于适应性免疫激活而非固有杀菌反应。这种免疫重编程损害了宿主的早期细菌清除能力，并可能促进免疫逃逸。与之前的报道