自动化幼虫运动力测定揭示捻转血矛线虫对埃普利诺菌素治疗失败与耐药性关联

　　本研究针对法国西南部奶羊场日益严重的埃普利诺菌素(EPR)耐药性问题，通过自动化幼虫运动力测定(WMiT)技术，首次系统验证了EPR治疗失败与捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)耐药性的直接关联。研究发现耐药株对EPR的IC50值较敏感株高出17-101倍，建立了快速、可靠的耐药性检测新方法，为奶羊寄生虫防控提供重要技术支撑。

　　

在当今全球畜牧业面临抗寄生虫药耐药性危机的背景下，法国西南部奶羊养殖业正遭遇前所未有的挑战。这片以原产地命名保护(PDO)奶酪闻名的重要产区，近年来出现捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)对埃普利诺菌素(EPR)治疗无效的严重问题。EPR作为目前唯一批准用于奶制品生产且无需休药期的抗寄生虫药，其失效不仅威胁动物健康福利，更直接影响着PDO奶酪生产的经济可持续性。

传统的粪便虫卵计数减少试验(FECRT)虽然能评估临床疗效，但存在耗时费力、灵敏度低等局限，往往在出现明显治疗失败后才能检测到耐药性。体外诊断方法如幼虫发育试验(LDA)虽提供了一种替代方案，但需要新鲜样本快速处理，操作繁琐且对莫西菌素(MOX)的耐药性检测灵敏度有限。因此，开发快速、可靠的耐药性检测方法成为当务之急。

在这项发表于《Veterinary Research》的研究中，Petermann等研究人员开展了一项系统研究，旨在建立EPR耐药性与治疗失败之间的直接联系，并验证自动化幼虫运动力测定在耐药性检测中的适用性。研究团队从法国西南部六个奶羊场收集了捻转血矛线虫分离株，其中四个来自EPR治疗失败的农场，两个来自治疗有效的农场，同时使用两个实验室敏感参考株进行对比。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过粪便虫卵计数减少试验(FECRT)评估田间EPR治疗效果；利用幼虫发育试验(LDA)测定药物对虫体发育的抑制效应；采用自动化幼虫运动力测定(WMiT)技术定量评估药物对第三阶段幼虫(L3)运动能力的抑制；所有田间分离株均通过实验感染羊群进行纯化和扩增，确保样本纯度。

田间分离株的收集与表征

研究团队成功纯化和扩增了六个田间分离株，其中四个(Ar、Be、Bu、Mo)来自EPR治疗效果差(FECRT<90%)的农场，两个(Ch、Lu)来自EPR治疗有效(FECRT>95%)的农场。通过FECRT验证了这些分离株的耐药性状态，为后续实验提供了可靠的材料基础。

幼虫运动力测定方法的验证

研究人员首先验证了实验条件的可靠性。使用左旋咪唑(LEV)作为阳性对照，证明WMiT assay能有效检测药物对幼虫运动力的抑制效果，IC₅₀值在9-50μM之间。这一结果与此前报道的哈曼chus contortus对LEV的敏感性数据一致，表明实验系统运行正常。

大环内酯类药物对不同分离株的效力差异

研究发现，所有三种大环内酯类药物(IVM、MOX、EPR)都能显著影响虫体运动力，但效力存在明显差异。在四个敏感分离株中，MOX显示出最强的效力，IC₅₀值最低。值得注意的是，来自英国的Weybridge参考株与法国本土分离株在药物敏感性模式上存在差异，提示可能存在地域性或遗传因素导致的药效反应差异。

对四个推定EPR耐药分离株的测试结果显示，与Humeau参考株相比，这些分离株对所有三种大环内酯类药物都表现出明显的右移曲线，表明药物效力降低。这种变化对EPR尤为显著，耐药分离株的EPR IC₅₀值在8.16-32.03μM之间，而敏感株仅为0.3μM。计算得到的耐药因子(RF)显示，EPR的RF在17-101之间，IVM的RF在2.3-10.8之间，MOX的RF在1.1-3.4之间。这些数据清晰地表明，WMiT assay能有效区分EPR敏感和耐药分离株。

运动力测定与幼虫发育试验的结果比较

对比WMiT和LDA两种方法的检测结果发现，对于敏感分离株，两种方法得到的IC₅₀值量级相似。然而对于耐药分离株，WMiT检测到的EPR IC₅₀值增加幅度远大于LDA。对于IVM和MOX，两种方法都观察到IC₅₀值增加，但WMiT检测到的变化更为明显。这一发现表明LDA在检测EPR耐药性方面灵敏度不足，而WMiT能提供更准确的耐药性评估。

研究结论与意义

本研究通过自动化幼虫运动力测定技术，首次在法国西南部奶羊场验证了捻转血矛线虫对埃普利诺菌素的耐药性与临床治疗失败之间的直接联系。研究发现EPR耐药分离株对EPR的IC₅₀值比敏感株高出17-101倍，且这些耐药株对其它大环内酯类药物也表现出不同程度的交叉耐药性。

该方法具有快速、标准化、重复性好等优点，能在获得幼虫后1.5天内完成检测，且只需中等数量的幼虫(少于15,000条L3)即可测试四种不同药物。相比传统的FECRT和LDA，WMiT技术更适用于田间耐药性监测和流行病学调查。

研究的实际意义在于为奶羊养殖业提供了早期检测EPR耐药性的可靠工具，帮助养殖者和兽医及时调整防治策略，选择有效药物，延缓耐药性发展。同时，该研究也警示了EPR耐药性的严重性，特别是某些分离株对其它大环内酯类药物也表现出增强的耐药因子，强调需要加强耐药性监测和综合防治措施。

从更广泛的视角来看，这种自动化运动力测定方法不仅适用于捻转血矛线虫和EPR，还有潜力应用于其他 nematode 物种和其他抗寄生虫药(如莫西菌素、左旋咪唑、莫奈太尔)的耐药性检测，为畜牧业寄生虫防治提供全面的技术支持。