基于多重免疫荧光单细胞蛋白质组学的肝细胞癌异质性分型及其临床意义

《Virchows Archiv》：Proteomic subtyping highlights tumor heterogeneity of human HCC

　　本研究针对肝细胞癌（HCC）分子异质性高、现有分子分型技术难以临床转化的问题，开发了基于4-plex多重免疫荧光（mIF）和多重光谱成像（MSI）的单细胞蛋白质组学分析方案。通过对58例HCC组织微阵列（TMA）进行单细胞分辨率分析，成功将HCC分为三个分子亚型（炎症/AKT-mTOR、β-连环蛋白/WNT信号、祖细胞样），并首次在蛋白质水平系统揭示了HCC普遍存在的瘤内异质性特征。研究发现祖细胞样亚型（EpCam+）患者生存期显著缩短，为HCC的精准分型和个体化治疗提供了重要的技术支撑和理论依据。

　　

肝细胞癌是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战。尽管高通量测序技术已经揭示了HCC存在不同的分子亚型，但这些基于基因组和转录组的分型方法由于技术复杂、成本高昂，难以在常规临床诊断中推广应用。与此同时，HCC的高度异质性被认为是导致治疗失败和耐药的关键因素，但蛋白质水平的异质性特征至今尚未系统阐明。

在这项发表于《Virchows Archiv》的研究中，研究人员创新性地将多重免疫荧光（mIF）技术与多重光谱成像（MSI）平台相结合，建立了能够在单细胞水平同时检测四种关键蛋白标志物的分析方法。研究团队从58例HCC患者的石蜡包埋（FFPE）组织中构建了组织微阵列（TMA），通过优化的4-plex免疫荧光面板（包含p-S6、CRP、GS和EpCam抗体）对肿瘤组织进行染色，利用机器学习算法进行细胞分割和单细胞蛋白质表达定量分析。

主要技术方法

研究采用58例HCC手术切除标本构建组织微阵列，通过优化的多重免疫荧光技术同时检测p-S6、CRP、GS和EpCam四种蛋白标志物。利用Vectra 3多重光谱成像系统采集图像信息，采用InForm软件进行细胞分割和蛋白质表达定量。通过非负矩阵分解（SNMF/R）算法进行无监督聚类分析，使用UMAP进行降维可视化，以纯度评分评估瘤内异质性程度。

单细胞蛋白质表达谱鉴定三种不同肿瘤簇

通过对223,846个HCC细胞进行单细胞蛋白质表达分析，研究人员成功识别出三个具有明显分子特征的肿瘤簇。Cluster A特征为p-S6和CRP共表达，代表AKT/mTOR信号通路激活和炎症特征；Cluster B以谷氨酰胺合成酶（GS）弥漫性高表达为特征，对应β-连环蛋白/WNT信号通路激活；Cluster C则以上皮细胞粘附分子（EpCam）高表达为标志，体现祖细胞样特征。这一发现与既往基于转录组的分型系统高度一致，验证了蛋白质水平分型的可靠性。

簇分布揭示肿瘤异质性

深入分析显示，这三种分子亚型在不同HCC病例中的分布存在显著差异。Cluster A细胞在24例肿瘤（41%）中占主导地位，Cluster B在21例肿瘤（36%）中为主要成分，Cluster C则在13例肿瘤（22%）中起主导作用。更重要的是，研究发现16例肿瘤的两个不同组织芯中出现了主导簇不一致的情况，强烈提示存在空间异质性。进一步计算纯度评分发现，仅有33%的HCC病例纯度评分≥0.95，意味着大多数HCC都存在不同程度的瘤内异质性。

簇与临床特征的关联

考虑到瘤内异质性的普遍存在，研究人员根据主导簇的纯度对HCC病例进行了重新分类。结果显示，24%的病例（14例）以Cluster A为主（纯度>0.80），14%（8例）以Cluster B为主，10%（6例）以Cluster C为主，而剩余52%（30例）因纯度较低被归类为未明确分型。生存分析发现，Cluster C主导的HCC患者中位总生存期显著缩短，而其他临床病理特征（如病因、肝硬化 prevalence、肿瘤分级、UICC分期等）在各亚型间无显著差异。

研究结论与意义

该研究成功建立了基于蛋白质表达的HCC分子分型系统，将HCC分为三个与已知分子类别一致的亚型：炎症型（Cluster A）、β-连环蛋白/WNT信号激活型（Cluster B）和祖细胞样型（Cluster C）。尤为重要的是，研究首次在单细胞蛋白质水平系统揭示了HCC普遍存在的瘤内异质性，这一发现对理解HCC治疗抵抗机制具有重要意义。

研究证实，具有祖细胞样特征的HCC（Cluster C）患者生存预后较差，这与既往研究结果一致，进一步验证了该亚型的临床侵袭性。而瘤内异质性的普遍存在提示，传统的基于整体肿瘤样本的分子分型可能掩盖了肿瘤内部的复杂性，这为解释靶向治疗和免疫治疗疗效差异提供了新的视角。

该技术的临床应用前景广阔，特别是在活检标本分析方面。随着HCC诊断和治疗中活检应用的增加，将这种多重免疫荧光分型方法整合到常规病理诊断中，有望实现更精准的患者分层和治疗选择。此外，该平台还可用于治疗过程中肿瘤克隆演变的动态监测，为克服治疗耐药提供重要信息。

尽管研究存在TMA取样局限性和回顾性设计等限制，但其建立的蛋白质组学分型平台为HCC精准医疗提供了实用的技术工具。未来在更大规模的前瞻性研究中验证这一分类系统，并探索其与治疗反应的相关性，将推动HCC个体化治疗策略的优化和发展。