解码脂肪-大脑对话：肥胖来源的细胞外囊泡中特异性脂质 cargo 调控阿尔茨海默病β淀粉样蛋白聚集的机制研究

　　本刊推荐：本研究系统揭示了肥胖人群脂肪来源的细胞外囊泡（EVs）中脂质 cargo 的组成特征及其对β淀粉样蛋白（Aβ）聚集的调控作用。通过多维质谱脂质组学分析和体外ThT荧光动力学实验，发现肥胖相关EVs中溶血磷脂酰胆碱（LPC）和鞘磷脂（SM）等脂质种类可浓度依赖性地调节Aβ40和Aβ42的纤维化过程，为理解外周代谢紊乱与阿尔茨海默病（AD）进展之间的机制联系提供了新的分子视角。

　　

1 背景

阿尔茨海默病（AD）及其相关痴呆预计到2050年将影响全球约8200万人。肥胖作为AD最重要的可调控风险因素之一，其通过外周代谢紊乱促进AD进展的机制尚不明确。脂肪组织分泌的细胞外囊泡（EVs）可穿过血脑屏障，通过递送RNA、DNA、蛋白质和脂质等外源性分子破坏大脑微环境。尽管EV相关miRNA已被证明参与AD进展，但EV来源的脂质在加剧AD病理中的作用仍未得到充分解析。

2 方法

2.1 人类受试者与脂肪组织采集

研究采集了瘦型和肥胖个体的皮下（SQA）和内脏（VA）脂肪组织，所有样本在术中采集并于60分钟内处理。部分组织立即冷冻于液氮中用于脂质组学分析，另一部分用于脂肪细胞分离和EV提取。

2.2 人脂肪细胞来源EV的分离

采用切向流过滤（TFF）结合超滤方法从人脂肪细胞中分离富集外泌体的EVs，并通过微流控电阻脉冲传感（MRPS）、免疫磁珠捕获和外泌体表面标志物检测进行质量控制和表征。

2.3 体内EV分布可视化

通过尾静脉注射用ExoGlow?-Vivo标记的小鼠脂肪来源EVs，利用IVIS活体成像系统观察EV在体内的生物分布。

2.4 脂质组学分析

采用基于多维质谱的鸟枪法脂质组学技术，对EV样本进行脂质提取和分析。数据通过MetaboAnalyst 5.0进行处理和可视化，脂质浓度标准化为蛋白质含量（nmol/mg protein）。

2.5 异常值检测分析

使用Isolation Forest算法识别脂质组学数据中的潜在异常样本，并通过敏感性分析评估异常样本对结果的影响。

2.6 ThT检测试剂制备

将超纯重组人Aβ40和Aβ42（Sigma）溶解于1% NH₄OH中制备储备液。ThT（Sigma）溶解于PBS并通过0.2μm滤器过滤。所有脂质样品用分子级乙醇配制为100 mM储备液。

2.7 纤维化动力学检测

在384孔非结合表面微孔板中进行反应，最终体积40 μL。反应体系包含脂质样品、缓冲液C、ThT（20 μM）和Aβ42（20 μM）。使用BioTek Synergy H1酶标仪在37°C下监测荧光强度（Ex/Em = 440/484 nm）。

2.8 动力学数据呈现与统计学

使用曲线下面积（AUC）作为within-subject因子进行重复测量方差分析（ANOVA），并通过Dunnett's检验进行事后比较。结果以均值±标准误（SEM）表示。

3 结果

3.1 EV纯化与质量控制

从小鼠脂肪细胞分离的外泌体富集EVs在尾静脉注射后表现出高效的脑部生物分布。从人脂肪组织分离的EVs经鉴定粒径范围为60-300 nm，含有外泌体标志物CD63和脂肪细胞特异性蛋白脂联素，符合ISEV指南要求。

3.2 脂质组学分析

脂质组学热图显示瘦型和肥胖个体来源的EVs具有明显的脂质谱差异， hierarchical clustering将两组样本清晰分离。肥胖来源的EVs在多种脂质类别中表现出显著改变，特别是三酰甘油（TAG）、磷脂酸（PA）和鞘磷脂（SM）。相关性热图揭示了肥胖相关的脂质共调控网络重组，识别出10个离散的脂质模块（簇a-j）。值得注意的是，SM主要在肥胖中下调，而磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）主要上调。

3.3 Aβ纤维化评估

研究聚焦于脂质对Aβ纤维化的影响，因为淀粉样蛋白聚集是AD明确定义的病理标志和疾病进展中的关键步骤。研究采用纯化的体外ThT荧光检测方法评估脂质类型特异性对Aβ纤维化的影响。

3.4 脂肪酸与Aβ纤维化

棕榈酸（C16:0）在脂毒性条件（25-100 mM）下显著促进Aβ40和Aβ42聚集。在3.13 mM（代表病理 overload浓度）下，棕榈酸显著促进Aβ40聚集，但对Aβ42影响较小。油酸（C18:1）在6.25-50 μM浓度下引起Aβ40严重纤维化，甚至在生理病理浓度（0.39-3.23 μM）下仍可见Aβ40聚集。有趣的是，在中等浓度（0.1-0.2 mM）下，油酸显著抑制Aβ40的聚集速率。

3.5 SM与Aβ纤维化

选择三种生理相关的SM来源：牛奶SM（主要成分为SM 23:0）、鸡蛋SM（SM 16:0）和脑SM（SM 18:0）。在ThT纤维化检测中，SM 23:0在较高浓度（包括接近7 μM的生理相关水平）下显著增强Aβ聚集，但在较低浓度下这种促聚集作用明显减弱。在Aβ42系统中，低于2 μM浓度的SM 23:0似乎随时间抑制纤维化，表明存在潜在的双相效应。SM 16:0在高浓度和低浓度范围内均持续促进Aβ聚集，而SM 18:0对Aβ42表现出强烈的促聚集作用，对Aβ40的影响相对温和。

3.6 LPC与Aβ纤维化

选择鸡蛋LPC和LPC 18:0进行Aβ聚集实验。在较高病理生理浓度（1.56至100 μM）下，LPC 16:0显著促进Aβ40和Aβ42的聚集。这种促聚集作用在较低LPC 16:0浓度下减弱。出乎意料的是，LPC 18:0在所有测试浓度下对Aβ40均表现出强烈的促聚集作用，约比阳性对照组高出三倍。相比之下，它对Aβ42聚集的影响较轻微。

3.7 PE与Aβ纤维化

选择C18(Plasm)-20:4 PE、C18(Plasm)-18:1 PE、16:0/20:4 PE和16:0/18:1 PE进行ThT纤维化检测。在超生理浓度下，C18(Plasm)-20:4 PE和C18(Plasm)-18:1 PE均显著促进Aβ40和Aβ42聚集。有趣的是，在接近生理水平的浓度下，这些质醚PE继续增强Aβ40聚集，但对Aβ42聚集表现出显著的抑制作用。两种二酰基PE（16:0/20:4 PE和16:0/18:1 PE）均显示对Aβ40强烈的促聚集作用。

4 讨论

4.1 浓度依赖性脂质效应

脂质浓度对Aβ聚集的影响在不同脂质类型间差异显著。某些脂质表现出明显的剂量依赖性促进Aβ聚集，反映在动力学参数（如滞后时间T_lag、半最大荧光时间T_1/2和生长阶段持续时间T_grow）的逐步变化上—高浓度促进纤维化，而低浓度抑制纤维化。其他脂质则显示出不太可预测的模式，表明复杂的脂质-肽相互作用。

4.2 亚型特异性反应

同一脂质种类对Aβ40和Aβ42聚集可能产生相似或不同的影响，表明两种亚型之间的结构差异可能影响它们的脂质结合特性。鉴于Aβ神经毒性遵循非纤维状寡聚体>纤维>单体的等级顺序，聚集途径中的任何扰动都可能对疾病发病机制产生深远影响。

这些发现强调了脂质组成和浓度在调节Aβ聚集动力学以及AD病理中的关键作用。脂质分子与Aβ之间的相互作用可以通过相分离和凝聚物形成等生物物理过程促进病理聚集，有效创建成核平台或改变局部分子拥挤以加速寡聚体或纤维形成。