四顺反子荧光生物传感器CARMEN系统实现亚细胞钙信号实时检测与多室同步成像

　　本刊推荐：本研究开发了基于核糖体跳跃技术的四顺反子荧光生物传感器系统CARMEN，实现了细胞质、线粒体和内质网三个亚细胞区域内钙离子（Ca2+）信号的同步实时监测。该系统通过比例共表达光谱分离的Ca2+生物传感器（近红外细胞质探针NIR-GECO2G-NES、绿色线粒体探针CEPIA3mt和红色内质网探针R-CEPIA1er）及钙不敏感核定位蓝色荧光蛋白（NLS-mTagBFP2），解决了多传感器异源表达水平不均的技术瓶颈。研究成功验证了线粒体钙单向转运体抑制剂（MCUi）MCUi4与MCUi11对亚细胞钙动力学的差异化调控，为高内涵药物筛选提供了强大工具。

　　

系统设计与构建

研究团队开发了名为CARMEN的核糖体跳跃型四顺反子荧光生物传感器系统，该系统整合了三种靶向不同细胞器的基因编码钙指示剂（GECI）：靶向线粒体基质的绿色荧光探针CEPIA3mt（K_d=0.42 μM）、靶向内质网腔的红色荧光探针R-CEPIA1er（K_d=675 μM）以及靶向细胞质的近红外荧光探针NIR-GECO2G-NES（K_d=320 nM）。系统同时包含核定位的蓝色荧光参考蛋白NLS-mTagBFP2，通过T2A、P2A和E2A三种自切割肽序列实现四个组分的比例协调表达。这种设计确保了单个转录本能够产生等摩尔的四种功能蛋白，克服了传统共转染导致的表达水平异质性难题。

细胞验证与靶向特性

在HeLa S3、EA.hy926和人胰岛素瘤INS-1细胞系中的表达验证显示，所有细胞类型均成功表达了全部四种荧光蛋白组分。通过结构光照明显微镜（SIM）和共聚焦三维重构技术证实了各探针的正确定位：CEPIA3mt精准定位于线粒体网状结构，R-CEPIA1er标记内质网腔室，NIR-GECO2G-NES均匀分布于细胞质，NLS-mTagBFP2则特异性富集于细胞核。光谱交叉实验表明，在优化滤光片组合下，四个通道的荧光信号分离良好，最小化串扰干扰。线性相关分析证实四个组分表达水平呈高度正相关（R²>0.9），证明核糖体跳跃机制的高效性。

药理干预与钙动态监测

应用SERCA抑制剂2,5-二叔丁基氢醌（BHQ）处理细胞后，CARMEN系统成功捕获到亚细胞钙重分布过程：内质网钙库排空伴随细胞质钙浓度升高，而线粒体钙摄取响应存在细胞类型特异性差异。在HeLa和EA.hy926细胞中多数观察到线粒体钙升高，但INS-1细胞仅部分细胞呈现此现象，揭示了细胞类型特异的钙处理机制。

通过ATP刺激诱发IP₃介导的钙振荡实验显示，CARMEN可实时解析三室钙信号时序关系：细胞质钙响应最先出现（0-2秒），内质网钙释放同步发生，而线粒体钙摄取延迟显著（HeLa S3平均延迟11.1秒，EA.hy926延迟29.0秒）。振荡过程中，细胞质与内质网钙信号始终保持同步，而线粒体钙信号呈现振幅衰减的滞后响应模式。半定量校准估算静息状态下细胞质钙浓度约100 nM，线粒体基质钙约200 nM，内质网腔钙浓度超过100 μM。

线粒体钙调控机制研究

研究重点分析了两种新型线粒体钙单向转运体抑制剂（MCUi）MCUi4和MCUi11的 pharmacological effects。在无胞外钙条件下，100 μM ATP刺激引发内质网源性的钙释放。对照细胞中约60%呈现线粒体钙摄取，且响应强度与细胞质钙信号幅度正相关。经90分钟预处理后，MCUi4（30 μM）和MCUi11（10 μM）均显著抑制线粒体钙摄取，但对细胞质和内质网钙信号产生迥异效果：MCUi4同步抑制细胞质钙瞬变和振荡频率，而MCUi11反而增强细胞质钙信号并促进振荡行为。这种差异化效应提示二者可能通过不同分子机制影响ER-线粒体微域钙信号转导。

技术优势与应用前景

CARMEN系统首次实现单载体控制下的三室钙信号同步成像，其模块化设计允许替换不同动力学参数的钙指示剂（如GCaMP系列、NEMO等）。核定位蓝色荧光蛋白不仅提供内参标准化的功能，还可通过核质区室化（NCC）分析评估细胞衰老状态。研究证实HeLa S3细胞保持稳定NCC模式，而EA.hy926和INS-1细胞部分呈现NCC紊乱，提示系统兼具钙信号检测与细胞状态监控双重功能。

该系统为研究亚细胞钙信号网络提供了强大工具，特别适用于：①解析细胞器间钙信号传递时序关系；②筛选靶向细胞器钙调控元件的特异性药物；③研究代谢疾病、神经退行性疾病和癌症中的钙信号紊乱机制；④建立基于多参数读出的高内涵药物筛选平台。未来通过整合更多信号通路 biosensor（如cAMP、ROS等），可进一步拓展其在系统生物学研究中的应用广度。