基于ATR–FTIR光谱结合多元分析技术快速定量左氧氟沙星、降解产物及掺假物的创新方法研究

　　本文推荐一种基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR–FTIR）的创新分析方法，结合化学计量学模型（PCA与PLSR），实现了左氧氟沙星（LFX）在固体制剂中的快速、直接定量（线性范围30%–90%，R2>0.995），并成功识别降解与掺假（Ofloxacin/Ciprofloxacin）。该方法符合ICH/AOAC验证标准，无需复杂前处理，为药品质量控制提供了高效环保的解决方案。

　　

1 引言

傅里叶变换红外光谱（FTIR）是制药行业和监管机构中用于活性药物成分（API）鉴定的重要工具。红外光谱的吸收频率及其强度反映药物产品的官能团排列或化学结构，这一特性可用于API的定性与定量分析。近年来，分析科学家正开发基于FTIR的分析方法，将其作为快速、成本效益高的质量控制工具。ATR–FTIR光谱相比传统透射红外光谱具有样品处理简便的优势，只需将少量粉末置于折射指数晶体池上，无需前处理。此外，红外光谱对污染物或掺假物非常敏感，可通过新谱带的出现或典型谱带的微小变化显示显著改变。这些微小变化可通过化学计量学模型或多变量统计分析可靠识别。最常用的统计工具包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归分析（PLS），能够在PLS回归前通过笛卡尔平面显著展示微小变化及其定量。

左氧氟沙星（LFX）（C₁₈H₂₀FN₃O₄，分子量370.38）是氧氟沙星的异构体，属于氟喹诺酮类合成广谱抗生素。LFX一旦给药，通过结合DNA靶向细菌旋切酶和拓扑异构酶IV。药物剂量不足（由于API含量低或存储不当导致的降解）可能导致耐药性和严重副作用。因此，药品质量与安全监管在医疗体系中不可避免。所有情形呼吁一种快速、经济、直接的分析方法来研究和调控药品质量。目前有多种光谱和色谱方法可用于LFX片剂分析，但许多方法需要大量样品制备/提取、选择性差且涉及使用有害溶剂。此外，多数色谱方法耗时、设备昂贵且需要实验室专家的专业知识。

利益相关者目前寻求现场、快速、直接的药物分析以实现高效分析服务。为此，本研究旨在开发一种快速、直接的测定方法，用于定量固体配方中的LFX。此外，通过多变量统计分析和偏最小二乘回归分析识别可能的降解和掺假并进行定量。

2 材料与方法

2.1 化学品与样品收集

LFX认证参考物质（CRM）标准品购自德国Sigma Aldrich。不同品牌的LFX API商业样品（Leflox 500 mg、Floxolev 500 mg和Curafloxin 500 mg）从拉合尔当地药店购买。常用不同赋形剂的USP级混合物（淀粉粉、微晶纤维素、乳糖一水合物和滑石粉）从巴基斯坦拉合尔当地制药公司获取。

2.2 样品与校准标准品制备

使用CRM LFX和稀释剂（LFX配方中常用赋形剂的特定比例混合物）制备一系列校准标准品（30%–90%），最终重量为300 mg。这些制备的API和赋形剂不同浓度的固体混合物如表1所述。通过称量赋形剂和API的不同比例制备这些（固体/固体）物理混合物，以获得所需浓度，并通过充分混合长时间仔细处理混合物的均匀性，以获得明确且可量化的光谱。测试样品（每种样品20片）分别在研钵中粉碎10分钟，以获得均匀混合物的细粉。为了获得回归模型，所有这些校准标准品和测试样品直接放置在ATR–FTIR的透镜上。

故意用氧氟沙星（OF 1&2）和环丙沙星（CF 1&2）掺假测试样品。混合物充分均质化，并获取FTIR光谱。强制降解是国际协调理事会（ICH）指南推荐的进行稳定性研究的程序。测试样品通过暴露于不同应激条件制备，如紫外-可见光（LE）、热（TE）和酸应激（AE）。LFX片剂（LE 1&2）暴露于阳光下。片剂置于清洁无湿气的透明容器中约一天，然后粉碎用于FTIR光谱。LFX片剂（TE 1&2）在120°C烘箱中放置6小时。测试样品AE 1&2暴露于酸雾（0.5 N HCl）中6小时，样品干燥、粉碎和均质化，并通过直接放置在FTIR透镜上收集光谱。

2.3 光谱采集与数据分析

所有稀释液，包括校准标准品（30%–90% w/w）和测试样品，使用Agilent 630-ATR-FTIR分光光度计扫描。该分光光度计配备温控钻石衰减全反射附件。FTIR通过其Micro Lab软件处理，获取校准标准品和样品的光谱。少量混合物直接放置在仪器的ATR透镜上，在环境实验室温度下进行。所有制备的校准标准品的光谱在传输模式（%T）下获取，光谱范围为4000–400 cm^?1，分辨率为2 cm^?1。图S7显示传输光谱，后在后期处理中转换为吸光度光谱。从ATR–FTIR获得的光谱数据通过Microlab Quant Software 5.1、Matlab-7.8和Essential FTIR软件进行后期处理。

2.4 方法开发与验证

通过符合ICH Q2（R1）指南“分析程序验证”建立定量方法的有效性。通过执行ICH指南中描述的参数建立所开发方法的有效性；特异性、线性、准确度、精密度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

2.5 特异性

通过纯API的单独FTIR光谱与赋形剂FTIR光谱的叠加确保所开发方法的特异性。特异性证明杂质、降解物和赋形剂的相互作用可能干扰方法的选择性。分析每种单独赋形剂的光谱，并建立对API的特异性。

2.6 线性、LOD和LOQ

在30%–90% w/w的浓度范围内确定所开发方法的线性，并通过测量R²值建立。曲线的线性通过相关系数（R²）以视觉方法获得。该校准曲线的斜率（峰面积与浓度）用于计算LOD和LOQ。

LOD和LOQ使用ICH指南中描述的公式计算。LOD = SD × 3.3/S，LOQ = SD × 10/S，其中SD是截距的标准偏差，S是校准曲线的斜率。

2.7 精密度

通过重复性和重现性（中间精密度）评估ATR–FTIR所开发方法的精密度。根据ICH指南，对三种不同浓度（30%、50%和70%）进行六次测定。获得的结果进行日内（重复性）和日间（重现性）相对标准偏差（% RSD）处理。

2.8 准确度

通过三种水平的LFX回收分析验证方法的准确度：低浓度80%、中浓度100%和高浓度120%。根据制造商标签声称，测试片剂的浓度为76.2%。为了制备这些标签声称的80%、100%和120%浓度，将标准和赋形剂添加到粉碎的片剂粉末中。使用这些浓度进行九次测定。FTIR分析中的准确度测量结果以实验发现与理论浓度值的比率呈现。

2.9 通过HPLC-PDA方法验证

使用美国药典LFX片剂专论，通过HPLC测定测试样品以及校准标准品的含量，以验证FTIR测试的结果。分析在配备光电二极管阵列检测器（2489 Waters）的HPLC（Alliance e2689 Waters）上进行。HPLC分析的色谱条件如下：流动相70%缓冲液（874 mg硫酸铜、918 mg L-异亮氨酸和5.94 g醋酸铵在1 L水中）和30%甲醇。分析使用的色谱柱为十八烷基硅烷（4.6 mm × 25 cm; 5 μm）。

3 结果与讨论

3.1 光谱表征、波数选择与基质干扰

LFX属于喹诺酮家族，具有特定化学结构，包含多个官能团，包括但不限于羰基（–CO）、醚键（–O–）、酸性基团（–COOH）、卤素（–F）、芳香环、叔胺等。红外光谱的能力源于组成不同官能团的共价键具有不同的吸收频率。吸收幅度取决于化合物中存在的官能团摩尔数，用于定量LFX。红外频率传输模式特别是在1800–800 cm^?1内反映官能团和指纹区域，通过显著频率模式，详情如表2所示。叔胺（C–N）的典型官能团在1350–1320 cm^?1显示频率吸收，而醚键（–O–）和卤素基团（C–F）分别在1080–1020和1400–1100 cm^?1区域显示吸收频率。

当探究配方中所述浓度的赋形剂与活性物质可能存在的干扰时，令人惊讶的是，没有额外的IR谱带干扰属于LFX的上述IR吸收谱带。赋形剂和API的叠加光谱图1显示在定量所选区域没有干扰。为了进一步明确可能存在的干扰，获取每种单独赋形剂和LFX的光谱，以建立该提议定量方法的特异性，如图S1–S4所示。图S5中4000至700 cm^?1的完整光谱范围也证明标准添加技术没有显示由于赋形剂中伴随吸收物种导致的光谱干扰（图S6）。

尽管所有这些官能团对LFX的浓度依赖性响应有特异性响应，如图2所示，最合适的区域应是显示所有定义参数可靠响应的区域。定量分析的谱带选择应产生强峰，对赋形剂具有显著选择性和特异性，并提供随校准物浓度增加而线性响应。一些官能团如C=O、C–N、C–F或COOH基团是最常用于定量目的的官能团，因为这些官能团表现出强、尖锐和分辨良好的峰。强峰提供更好的灵敏度和尖锐信号，增强特异性。因此，通过选择不同功能区域在峰面积和峰高处制作不同的校准曲线，用于校准模型，其结果如表3所示。

有趣的是，与峰高相比，峰面积在线性和稳健性方面表现出更好的响应，这表明在特定区域选择峰面积可能是模型的选择。在测试区域中，区域1显示校准模型最可靠和可重复的结果，并显示回归系数（R²）值为0.995，在ICH指南的接受范围内。所选区域1显示高摩尔吸光度，被认为是芳香C–F的伸缩谱带，是LFX的特征。该基团独特存在于LFX结构中；因此，它不经常与其他官能团的谱带重叠。因此，该官能团赋予LFX化学结构特异性，可选择用于方法开发。确实，C–F伸缩特别是芳香氟基团在1400–1200 cm^?1范围内产生尖锐和强的IR频率。因此，考虑到上述信息，LFX光谱在中IR区域显示显著频率谱带，最大波数位于1252和1218 cm^?1，选择用于LFX的定量（图3）。

3.2 方法验证的分析品质因数

3.2.1 线性、LOD和定量

在1218和1252 cm^?1的选定区域绘制简单回归线，用于IR吸光度响应与浓度范围，如表1所述，在30%–90% w/w的浓度范围内显示可接受的线性。y截距略微偏离零原点，但与零无显著差异，p < 0.05。此外，y截距变异性导致小于目标水平响应的1%，这通常是可接受的标准。回归线的统计显著性（R² > 0.995）也显示斜率的可工作性，p < 0.05，这反过来表明浓度变量的变化与响应变量的变化高度相关。LOD代表可区分物质的最小量，LOQ定义为可定量的最小物质。测试方法的LOD通过校准曲线的线性计算，确定为7.616% w/w。LOQ通过ICH指南测量，计算为23.079% w/w，结果如表4所述。

3.2.2 精密度

使用三种不同浓度水平计算所开发方法的精密度：低（30% w/w）、中（50% w/w）和高（70% w/w）校准浓度。通过重复性在外部测试中使用六个重复确保方法的精密度，并测量相对标准偏差。尽管所有测试浓度显示良好的重复性，具有% RSD <1，强烈同意接受标准≤2% RSD。然而，在测试浓度中，低浓度水平显示良好的重复性（0.652% RSD）。通过不同分析师的日间和日内精密度确保中间精密度。两项测试均进行五次重复，分别产生% RSD为0.852和0.451，显著低于接受范围≤2% RSD。从表5可以看出，重复性和仪器精密度数据满足方法精密度要求，用于定量固体剂型中的LFX。我们的发现与FTIR定量和固体剂型方法验证的报告一致。

3.2.3 准确度

ICH将准确度定义为通过开发方法获得的数据与实际值的接近程度。通过回收研究确保测试方法的准确度和效率。回收研究通过标准添加方法（标准加标）进行，并通过化学计量学模型测量量。有趣的是，所有回收量的结果均在良好的接受限内，通过% RSD确定，发现<1.2%的添加量，结果如表6所述。获得的平均回收百分比值范围从99.30到100.91，表明所提出方法的高准确度。回收百分比值在AOAC指定的范围内。

3.2.4 化学计量学模型

使用Micro Lab Quant软件设计化学计量学定量模型。在该模型中，使用一系列不同浓度（30%–90% w/w）的校准标准品构建校准曲线模型。所有校准标准品在4000–400 cm^?1区域扫描，选定区域的曲线下面积用于开发分析模型。校准曲线在1252–1218 cm^?1处的曲线面积达到回归系数R² = 0.995。在图4中，设计的化学计量学模型在选定区域显示良好线性，回归线方程为y = 3.475x + 0.2527，获得的线性符合ICH和AOAC指南的方法开发。

该化学计量学模型用于测试样品（盲样）的识别和含量测定。通过ATR–FTIR的化学计量学模型进行LFX片剂的含量测定，无需从剂型中提取到任何溶剂中。该方法需要细粉碎的粉末，直接应用于ATR–FTIR的透镜并扫描光谱，通过软件通过化学计量学模型进行算术计算。测试样品的含量值直接测量，结果如表7所示。

通过比较通过HPLC-PDA测量的含量值验证结果。通过HPLC测量的含量值