胶质母细胞瘤中细胞外囊泡与非囊泡纳米颗粒的异质性及其在血脑屏障穿透与肿瘤微环境调控中的功能研究
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时间：2025年10月04日
来源：Journal of Extracellular Vesicles 14.5
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本综述系统阐述了胶质母细胞瘤（GBM）中细胞外囊泡（EVs）与非囊泡性细胞外颗粒（NVEPs，包括exomeres和supermeres）的异质性。通过多组学分析，研究发现supermeres富含细胞外基质（ECM）重塑相关组分，能够穿越血脑屏障（BBB），并靶向小胶质细胞调控TGFβ1表达，为中枢神经系统（CNS）药物递送提供了新型载体。
胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的原发性脑癌，尽管采用手术切除、放疗和化疗等综合治疗手段，其中位生存率仍然不容乐观。表皮生长因子受体（EGFR）的扩增和突变与约70%的GBM病例相关，其中EGFRvIII作为EGFR的基因内重排形式，在50%的EGFR阳性病例中出现，导致受体不依赖配体而持续激活。尽管EGFR在GBM中被证实具有驱动突变功能，但EGFR抑制在临床环境中仍无效。
GBM治疗的主要障碍之一是其巨大的基因组和细胞异质性，这种多样性使GBM细胞能够通过适应和存活于多种细胞状态来逃避治疗。尽管对GBM相关基因突变已有大量研究，但关于GBM细胞与其周围肿瘤微环境相互作用的理解仍较少，这种相互作用是癌症进展和治疗抵抗的关键方面。GBM细胞与微环境中免疫细胞和支持细胞之间的有效通信使肿瘤能够生长、逃避免疫检测并抵抗治疗，理解这些相互作用对于开发能够破坏这些过程的疗法至关重要。
细胞外囊泡（EVs）是包括癌细胞在内的细胞释放到细胞外环境中的磷脂双层膜结合颗粒，这些囊泡含有DNA、RNA和蛋白质等生物活性分子，在细胞间运输，在细胞间通信中发挥关键作用。这种分子的转移可以影响各种生理和病理过程，包括疾病进展。近年来，EVs因其携带肿瘤源性生物标志物的能力而在癌症研究中引起广泛关注，这些标志物在血液、唾液和尿液等体液中循环，这种可及性使EVs成为非侵入性诊断工具和潜在治疗应用的有希望的候选者。
EV群体内的异质性通过它们在不同生物系统中执行的广泛功能得以体现，这种功能和组成的多样性表明EV远非均匀，强调需要更详细的表征以充分理解它们在健康和疾病中的不同作用和潜在应用。随着EV研究的扩展，细胞间通信领域也在不断扩大，现在包括最近发现的无膜非囊泡性细胞外纳米颗粒（NVEPs）类别，如exomeres和supermeres。
Exomeres是一种不同于传统EVs的细胞外颗粒，尺寸小于50纳米，缺乏磷脂双层，并且不是通过标准的EV生物发生过程（如多泡体与质膜的出芽或融合）形成。富含蛋白质、核酸和某些脂类等生物活性分子，exomeres与细胞信号传导和癌症进展相关过程（如细胞粘附、迁移和免疫反应调节）有关。Supermeres是一类更小的细胞外纳米颗粒，与exomeres共享一些物理化学特征，特别是缺乏磷脂膜和独特的生物活性组成。Supermeres含有癌症特征蛋白，并正在成为生物标志物发现、诊断开发和治疗策略的有希望靶点。
从人源GBM PDX细胞培养物GBM6、GBM39和GBM59以及HEK-293和GL261细胞中分离的15k EVs、167k EVs、exomeres和supermeres用近红外（NIR）IRDye 800 CW NHS酯标记，按照制造商方案进行。标记的15k EVs通过SW28摆平转子以10,000 g离心60分钟沉淀，标记的167k EVs通过SW41 Ti摆平转子以167,000 g离心4小时沉淀。标记的exomeres通过SW41 Ti摆平转子以167,000 g离心16小时沉淀。Supermeres使用Beckman Coulter SW55 Ti转子以367,000 g离心16小时沉淀。样品重悬于PBS（pH 7.4）并再次沉淀。通过实验确定，在用于纯化标记supermeres的离心和洗涤方案后，潜在的未结合IRDye 800 CW染料聚集体未残留。标记样品（150 μg于200 μL PBS）通过尾静脉注射到8周龄雄性CD1或C57Bl6/J小鼠体内。注射后6或24小时收取器官，使用Odyssey成像系统成像。使用Image Studio软件分析每个器官中积累的IRDye 800的平均荧光强度。所有动物研究和程序均经Beth Israel Deaconess医疗中心机构IACUC批准（协议号032–2025）。将supermeres（150 μg蛋白质）在100°C下变性10分钟，或用RNase（RNase A/T1 Mix）在37°C下以1 μg/mL处理30分钟，或用DNase（DNase I）在37°C下以1 U/mL处理30分钟。处理后，所有样品以367,000 g超速离心16小时以分离supermere沉淀。所得沉淀重悬于200 μL PBS中，通过尾静脉注射到小鼠体内。24小时后，处死小鼠，收取器官进行分析。
小鼠（CD-1）通过尾静脉注射NIR标记的supermeres，48小时后用20 mL PBS灌注两次，然后用20 mL新鲜制备的4%多聚甲醛（PFA）灌注。仔细收集大脑，在4°C下浸入4% PFA中过夜，随后转移到30%蔗糖溶液中脱水48小时，然后包埋在Tissue-Tek O.C.T.化合物中，并使用冷冻切片机切成10 μm厚切片。冷冻切片在-20°C预冷丙酮中固定10分钟，用PBS洗涤三次，在4°C下使用0.3% Triton X-100渗透20分钟，然后在4°C下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时以减少非特异性结合。将一抗应用于切片并在4°C湿润室中孵育过夜。第二天，用PBS洗涤切片三次，并在室温下与荧光标记的二抗孵育1小时，避光。二抗染色后，使用含DAPI的抗褪色封片剂封片，并盖上盖玻片。载玻片在室温下干燥1小时。使用共聚焦显微镜对染色切片成像，并使用ZEN Black和ZEN Blue软件分析数据。
EGFRvIII阳性PDX细胞GBM6、GBM39和GBM59在补充有10% EV清除胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的DMEM中维持。在收获条件培养基用于下游分析之前，细胞在无酚红、无FBS的DMEM中培养24小时，并补充青霉素-链霉素。然后通过以400 g离心10分钟（4°C）和2000 g离心20分钟（4°C）去除条件培养基中的完整细胞（活细胞和死细胞）和细胞碎片。
根据已发布的方案，使用配备SW28、SW41 Ti、SW32 Ti和SW55 Ti转子的Beckman Optima XL-90超速离心机分离EVs和NVEPs。为分离15k EVs，将条件培养基在4°C以15,000 g离心60分钟以沉淀15k EVs。所得沉淀重悬于PBS中，并在4°C以15,000 g进行第二次离心60分钟。为分离167k EVs，将去除15k EV的上清液通过0.22 μm聚醚砜滤器过滤，以尽量减少较大囊泡的污染。使用100,000分子量截留的离心浓缩器浓缩滤液。使用SW32 Ti摆平转子将浓缩样品在4°C以167,000 g离心4小时以沉淀167k EVs。将167k EV沉淀重悬于含有25 mM HEPES（pH 7.2）的PBS中，并通过在相同条件下以167,000 g额外离心4小时进行洗涤纯化。为分离exomeres，将167k EV分离的最后离心步骤获得的上清液在4°C以167,000 g超速离心16小时。所得exomere沉淀重悬于含有25 mM HEPES（pH 7.2）的PBS中，并通过第二次以167,000 g超速离心16小时进行洗涤。为分离supermeres，将去除exomere的上清液使用SW55 Ti转子在4°C以367,000 g进一步超速离心16小时。所得沉淀（富含supermeres）重悬于含有25 mM HEPES（pH 7.2）的PBS中，并通过第二次以367,000 g超速离心16小时进行洗涤。所有四种类型的EV和NVEP沉淀均悬浮于200 μL含有25 mM HEPES的PBS中，并储存于-80°C。
2.4 15k EVs和167k EVs的流式细胞术
使用vFC囊泡流式细胞术EV分析试剂盒进行EVs的流式细胞术分析。来自GBM细胞的15k EVs和167k EVs稀释至约1×10?–1×10?颗粒/μL的浓度于染色缓冲液中。为评估EV大小和EV表面 cargo，将GBM来源的15k EVs（每孔50 ng）和167k EVs（每孔10 ng）与vCAL NanoRainbow beads（包含在检测试剂盒中）一起用vFRed膜 stain和直接偶联的一抗抗体染色，染色反应在室温避光条件下进行60分钟。染色后，将反应混合物在染色缓冲液中稀释1:1000，使用CytoFLEX流式细胞仪以60 μL/min的样品采集速度运行120秒每次。收集数据并分析以通过De Novo软件确定EV大小。
为定量囊泡浓度和大小分布，将细胞一式三份接种，生长至80%汇合度，用PBS洗涤两次，并在含0.1% FBS的无酚红DMEM中过夜生长。然后在新鲜无酚红DMEM（含0.1% FBS）中收获EVs 24小时。通过300 g和2000 g离心分别清除条件培养基中的活细胞和细胞碎片。使用Nanosight LM10对澄清的培养基未稀释成像，相机水平=15，屏幕增益=1.0。每帧颗粒范围在10到100个颗粒之间。使用NTA 3.1软件分析视频记录，屏幕增益=3.0。每个条件培养基样品成像三次并取平均值。收集培养基后，对细胞进行计数以给出囊泡/mL/细胞计算的分母。每个孔的细胞和EVs配对，相应的值在生物学重复上平均，以得出每个细胞系的囊泡定量。
将新鲜辉光放电的formvar和碳涂层镍200目网格漂浮在10 μL样品滴上（浓度范围在90至400 ng/mL蛋白质之间）吸附5分钟，然后用滤纸吸干网格边缘。然后将网格漂浮在2%乙酸铀酰水溶液滴上1分钟，然后用滤纸吸干并完全干燥，然后在JEOL JEM-1400 TEM中以120Kv成像，配备Gatan Orius SC1000数字CCD相机。在网格中心和四个象限拍摄图像。使用ImageJ实现EVs和ENPs的大小（直径）测量和量化。
立即在使用前在冰冷PBS中制备碘克沙醇（OptiPrep）密度介质的不连续步骤（12%–36%）梯度。将15k EVs和167k EVs的沉淀重悬于冰冷PBS中，并与冰冷碘克沙醇/PBS混合至最终36%碘克沙醇溶液，将其加入离心管底部，并单独顶部分层递减浓度的碘克沙醇/PBS溶液以完成梯度。生成不含样品的平行梯度以确定级分密度。使用SW41 TI摆平转子（k因子124，Beckman Coulter）在4°C以120,000 g超速离心12%–36%梯度15小时。从梯度顶部收集12个单独的1 mL级分。对于免疫印迹和银染SDS-PAGE，将每个单独的1 mL级分转移到新的超速离心管中，用PBS稀释12倍，并在4°C使用SW41 TI摆平转子以120,000 g超速离心4小时。所得沉淀在冰上用RIPA细胞裂解缓冲液裂解。
用于蛋白质组学分析的样品制备如下：通过裂解在250 μL的8 M尿素、200 mM EPPS pH 8.5中（补充蛋白酶抑制剂）从指示级分中提取250 μg蛋白质，并使用注射器（10次冲程，1.5英寸，21G针头）剪切DNA。样品用5 mM中和的TCEP还原15分钟（室温），并在室温避光条件下用10 mM碘乙酰胺烷基化30分钟，随后用5 mM DTT淬灭15分钟（室温）。然后使用甲醇-氯仿沉淀提取100 μg蛋白质。简言之，向样品（100 μg于~100 μL）中加入400 μL 100%甲醇并涡旋5秒，随后加入100 μL 100%氯仿并涡旋5秒。加入300 μL水并涡旋5秒，然后在14,000 g离心1分钟。小心去除水相和有机相，在管中留下蛋白质界面。用400 μL 100%甲醇洗涤样品，并在室温下以21,000 g离心2分钟，弃去上清液，沉淀不完全干燥。将样品重悬于100 μL 200 mM EPPS（pH 8.5）中。
对于蛋白质消化和质谱分析准备，将样品重悬于100 μL 100 mM EPPS（pH 8.5）中，并在37°C下以100:1的蛋白质与蛋白酶比例用胰蛋白酶消化过夜。通过StageTip对样品进行脱盐，通过真空离心干燥，并重悬于5%乙腈、5%甲酸中以进行LC-MS/MS处理。使用以下之一收集质谱数据：（1）与Proxeon 1200液相色谱仪耦合的Exploris 480质谱仪，在DDA模式下。肽段在填充约35 cm Accucore C18树脂（2.6 μm, 150 ?）的100 μm内径微毛细管柱上分离。上样约1 μg到柱上。使用75分钟梯度（3%–22%乙腈，0.125%甲酸，流速350 nL/min）分离肽段。扫描序列以Orbitrap MS1谱图开始，参数如下：分辨率120,000，扫描范围350?1200 Th，自动增益控制（AGC）目标：300%，最大注入时间：25 ms，RF透镜设置：50%， centroid谱图数据类型。选择前二十个前体进行MS2分析，包括HCD高能碰撞解离，参数如下：分辨率30,000，AGC设置为“标准”，最大注入时间：60 ms，隔离窗口：1.2 Th，归一化碰撞能量（NCE）28，centroid谱图数据类型。此外，未分配和单电荷物种被排除在MS2分析之外，动态排除设置为60秒。（2）与Proxeon NanoLC-1200 UHPLC耦合的Orbitrap Fusion Lumos仪器。100 μm毛细管柱填充约35 cm Accucore 150树脂（2.6 μm, 150?），流速360 nL/min。上样约1 μg到柱上。每个样品采集数据70分钟。使用75分钟梯度（3%–22%乙腈，0.125%甲酸，流速350 nL/min）分离肽段。扫描序列以MS1谱图（Orbitrap分析，分辨率60,000，400–1400 Th，自动增益控制（AGC）目标100%，最大注入时间50 ms）开始。hrMS2阶段包括通过高能碰撞解离（HCD，归一化碰撞能量30%）进行碎片化，并使用Orbitrap（AGC 200%，最大注入时间22 ms，隔离窗口1.3 Th，分辨率15K）进行分析。使用FAIMSpro接口采集数据，分散电压（DV）设置为5000 V，补偿电压（CVs）设置为-40 V、-60 V和-80 V，TopSpeed参数设置为每个CV 1秒。
使用修改版本的ReAdW.exe将MS谱图转换为mzXML。数据库搜索包括来自人类UniProt数据库的所有条目（2020年9月下载），并与由所有蛋白质序列以反向顺序组成的反向数据库连接。搜索使用50-ppm前体离子容差，产物离子容差设置为0.03 Th。允许最多两个漏切，允许电荷状态在2到6之间，肽段长度限制在7到60个残基之间。甲硫氨酸残基的氧化（+15.9949 Da）设置为可变修饰。将肽段谱匹配（PSMs）更改至1% FDR。使用线性判别分析进行PSM过滤，同时考虑以下参数：XCorr、ΔCn、漏切、肽段长度、电荷状态和前体质量精度。将肽段-谱匹配折叠至1% FDR，然后进一步折叠至最终蛋白质水平FDR为1%。此外，蛋白质组装由简约原则指导，以产生解释所有观察到的肽段所需的最小蛋白质集。对于定量和下游数据分析，提取谱图计数并随后转换为标准化谱图计数丰度因子。
从各种EV和NVEP制备物中分离的蛋白质在RIPA裂解缓冲液中分离，并通过BCA定量。将来自每个级分的等量蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶上，并通过银染分析等量上样。运行校正后的等量蛋白质并通过蛋白质印迹检查。使用的抗体如下：一抗：抗EGFR、（1:1000, CST, #4267），抗CD9、（1:1000, CST, #13403），抗CD63、（1:1000, CST, #52090），抗CD81、（1:1000, CST, # 52892），β-Actin、（1:1000, CST, #3700），抗Calnexin、（1:1000, CST, #2433），抗Annexin A2、（1:1000, CST, #8235），抗Cytochrome C、（1:500, CST, #11940）。来自LI-COR的二抗、（1:10000, IRDye 680RD山羊抗小鼠, #926-68070, IRDye 800CW山羊抗兔, # 926–32210）。
对于批量RNAseq，使用Qiagen microRNA分离试剂盒从EVs和NVEPs中分离总RNA，按照制造商推荐。从相应的源PDX培养物中分离总细胞RNA并并行分析。通过分光光度计（NanoDrop 2000）和Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒分别测定细胞和EV/NVEPs RNA的浓度。使用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA质量，并估计RNA完整性数值（RIN）。使用Ribo-Zero rRNA去除试剂盒对总RNA（40–200 ng EV/NVEPs RNA或2 μg细胞RNA）进行rRNA去除。将rRNA去除RNA的四分之一使用5× First-Strand Buffer片段化至100–500 nts，并利用SMARTer Stranded RNA-Seq Kit用于批量RNA文库构建。使用Agilent DNA 1000试剂盒在Agilent 2100 Bioanalyzer仪器上检查文库质量，并通过qRT-PCR定量cDNA。在Dana Farber哈佛医学院测序核心设施使用HiSeq 2000对文库进行单读75个循环测序。RNA-seq原始读数为反向链特异性配对末端读数。使用fastp修剪接合器和polyX尾巴，然后通过测序Phred质量（≥ Q15）过滤。将修剪接合器的读数使用STAR aligner与两遍选项比对到基因组。在第一遍中映射整个基因组的读段以识别新的剪接连接。然后将这些新注释纳入参考索引中，并在第二遍中使用此新参考重新比对读段。为了从基因组比对中估计基因表达，使用RSEM，一种用于从RNA-Seq数据准确量化基因和异构体表达的工具。然后使用kallisto将读段与人类转录组（Ensembl版本104）比对，并使用tximport将转录本计数转换为基因计数。映射基因计数的基因生物型比例来自转录组比对。注意，rRNA物种被排除，并且仅显示最丰富的12个物种，所有剩余物种被折叠。为过滤低表达基因，保留在至少四个样本中每百万计数（CPM）大于0.46的基因。过滤后有43,060个基因。为了在后续分析中使用线性模型，执行Voom变换将计数转换为logCPM，其中logCPM = log2(106×计数/文库大小)。Voom变换估计均值-方差关系并使用它计算适当的观察水平权重，以便更多读长深度赋予更多权重。为提取差异表达基因，使用limma R包进行线性建模和调节t检验以检测组间差异表达基因，其中SVs作为协变量。为发现五组之间差异表达的基因，使用limma R包进行线性建模和调节F检验，并调整SVs。随后选择显著基因（F检验FDR < 0.01）。基于这些选定基因的欧几里得距离进行层次聚类分析，并使用可变切割高度方法检测层次树状图中的基因簇。
对于小RNA-seq，使用Illumina短读平台完成高通量小RNA测序（sRNA-seq）。使用miRNAEasy分离试剂盒从细胞、EVs和NVEPs中分离总RNA。使用NEXTFlex小RNA文库制备试剂盒v3与UDIs构建sRNA文库，并进行以下修改：（1）3′-和5′-适配器稀释1:8，（2）3′-适配器连接在25°C进行2小时，20°C进行4小时，16°C过夜分多步进行，（3）遵循cDNA合成并在条形码PCR之前，使用修改的步骤F协议，（4）20个循环的PCR扩增。使用PippinPrep预制盒对单个文库进行大小选择（136–200 bp），并在Qubit荧光计上定量。在VANTAGE DNA测序核心（范德比尔特大学，纳什维尔，TN）使用NovaSeq6000对等摩尔多路复用文库进行配对末端测序（PE-150）。使用TIGER数据分析管道完成下游分析。使用Cutadapt进行3′适配器修剪，>16 nts的读段用于比对（hg19基因组），并附加rRNA和tRNA参考序列，由Bowtie1允许一个错配（1 MM）进行比对。丢弃<20 nts且未能注释为sRNA或未能与人类基因组完美比对的读段。对于长和小RNA文库的类别组成分析，使用校正后的非rRNA总丰度用于样本间标准化。使用Limma R包对log2转换的标准化读段计数进行层次聚类分析。使用gplots R包中的Venn函数生成维恩图，并在Adobe Illustrator中进一步注释。
使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定和定量从EVs（15k×g和167k×g级分）中提取的非共价结合脂质。通过Bligh–Dyer脂质分离方法提取脂质，并在范德比尔特大学医疗中心质谱核心使用Vanquish Horizon UPLC系统进行分析，然后注入QExactive混合四极杆/Orbitrap高分辨率质谱仪。使用MS Dial v4.9进行下游分析。使用所有样品的等体积混合作为质量控制（QC）样品。还包括空白、溶剂阴性对照和水性内标（AIS；Equisplash lipidomix）。去除（a）QC样品相对标准偏差（RSD）>20%，（b）空白/QC值>10%，和（c）命名问题（未知、无ms2和RIKEN）的脂质物种。使用LOWESS方法标准化数据。对于exomeres和supermeres分析，使用液-液甲基叔丁基醚（MTBE）提取方法从级分中分离脂质，并在Beth Israel Deaconess医疗中心质谱（蛋白质组学/代谢组学）核心开发的LC-MS/MS平台上进行分析。该高分辨率脂质组学程序在正/负离子切换模式下使用C18反相色谱，在数据依赖分析（DDA）模式下在QExactive Plus Orbitrap质谱仪上运行。使用LipidSearch 4.1软件鉴定单个完整脂质分子。
将130 μL 5×10?囊泡/mL的GBM 15k EV和167k EV样品在DPBS中通过Spin-X离心管过滤器（0.45 μm孔径，纤维素乙酸酯膜）以12,000 RCF离心2分钟。接下来，添加2.0 μL 14 nM每种抗体，抗-CD9-PE、抗-CD81-PE/Cy7、抗-CD63-Alexa488和抗-EGFR-Alexa647，并在室温避光条件下孵育1小时。然后，添加1.3 μL 10 μM di-8-ANEPPS并在室温避光条件下孵育1小时。然后通过具有30 nm孔径的SEC柱纯化样品。然后，向98 μL洗脱液中添加2 μL 0.05% BSA，并将10 μL此混合物上样到微芯片上并置于dFC上进行分析。
将HMC3细胞接种在六孔板中并培养直至细胞汇合度达到约90%。此时，将标记有IRDye 800的supermere颗粒引入细胞以评估摄取。具体地，向每孔添加50 μg IRDye 800标记的supermere于200 μL PBS中。在37°C孵育6小时后，用PBS洗涤细胞三次以去除任何未结合的supermere颗粒。然后收获处理的细胞，并通过流式细胞术量化IRDye 800标记的supermere的摄取。通过确定IRDye 800荧光阳性细胞的百分比，提供supermere内化的度量。
用最终浓度50 ng/mL的脂多糖（LPS）以及来自GBM6、GBM39和GBM59以及HEK-293和GL261细胞的supermere颗粒（每种浓度50 μg/mL）处理HMC3细胞。在37°C孵育24小时后，用PBS洗涤细胞三次以去除任何未结合的supermere颗粒。然后使用QIAwave DNA/RNA Mini Kit从处理的细胞中提取RNA，按照制造商方案。使用HiScript IV RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）进行互补DNA（cDNA）合成，并使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix进行qPCR，按照制造商指南。目标基因的引物序列报告在表S8中。使用标准qRT-PCR方案量化基因表达，并使用比较Ct方法计算相对表达水平。所有试验一式三份进行，并在每次实验中包括适当的对照。使用LPS检测试剂盒评估supermeres中的LPS水平，按照制造商方案。
