循环微凝块与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的结构性关联及其在长新冠（Long COVID）患者中的升高现象

　　本研究发现长新冠（LC）患者体内循环微凝块（microclots）与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）标志物（MPO、NE、cirDNA）存在显著定量与结构关联，揭示其通过稳定微凝块导致血管阻塞和慢性缺血再灌注损伤，为长新冠的血栓炎症机制提供了新的诊断视角（AUROC达0.95）和治疗靶点。

　　

1 引言

长新冠（LC）作为SARS-CoV-2感染后的持续性综合征，影响全球数百万患者，其多器官症状与免疫失调和血栓炎症密切相关。近期研究表明，LC与异常纤维蛋白（原）淀粉样微粒（微凝块）及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的升高有关，二者均参与血栓炎症过程。本研究旨在探索微凝块与NETs之间的关联性，揭示其在LC病理机制中的作用。

2 材料与方法

2.1 研究设计与队列

研究纳入南非（14名）和法国（24名）健康对照者（HI），以及50名LC患者。通过成像流式细胞术和荧光显微镜技术，定量分析血小板匮乏血浆（PPP）中的微凝块数量、大小及NETs标志物（MPO、NE、cirDNA）。采用随机森林（RF）机器学习模型评估标志物的诊断性能。

2.2 样本处理与检测

血浆样本通过两步离心（1200×g和16000×g）制备，以排除细胞碎片干扰。微凝块使用Thioflavin T（ThT）染色，NETs标志物通过ELISA和qPCR定量（cirDNA检测KRAS基因67 bp片段）。共聚焦显微镜用于验证微凝块与NETs的结构共定位。

2.3 统计分析

采用Mann-Whitney U检验比较组间差异，Spearman相关性分析评估变量关联，机器学习模型通过五折交叉验证（100次重复）确保鲁棒性。

3 结果与讨论

3.1 微凝块与NETs标志物的定量关联

LC患者微凝块总数显著高于HI（19.7倍差异，p=1.97×10^?12），且100–400 μm²尺寸范围的微凝块数量与NETs标志物（cirDNA、MPO、NE）呈强相关性（Spearman R>0.7）。NETs标志物在LC血浆中分别升高5.7倍（cirDNA）、3.5倍（MPO）和14.9倍（NE）。ROC曲线显示微凝块计数（AUROC=0.90）和NETs标志物组合（AUROC=0.95）具有极高诊断价值。

3.2 微凝块与NETs的结构共定位

荧光显微镜显示，LC患者微凝块（ThT⁺）与NETs成分（Hoechst⁺ DNA、MPO、NE）存在明显共定位，表明NETs可能作为微凝块的结构组成部分。体外实验证实， Spike蛋白或LPS可诱导纤维蛋白原形成淀粉样微凝块，且与NETs标志物共染色。

3.3 机制推测：NETs稳定微凝块并加剧血栓炎症

微凝块与NETs的关联可能通过以下机制加剧LC病理：

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  免疫血栓循环：活化的血小板与中性粒细胞相互激活，形成NETs，后者通过P-selectin/HMGB1等通路促进微凝块稳定化。
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  纤溶抵抗：NETs提供的DNA支架和蛋白酶（如NE）抑制纤溶过程，导致微凝块持续存在。
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  内皮损伤：微凝块阻塞毛细血管，引发缺血再灌注损伤和自身抗体形成，维持慢性炎症。

3.4 诊断应用与模型性能

随机森林模型基于微凝块数量（100–400 μm²）和MPO浓度，实现LC与HI的准确区分（灵敏度0.88，特异性0.98）。混淆矩阵显示93% LC患者和88%健康个体被正确分类。

4 结论

本研究首次揭示LC患者中循环微凝块与NETs的结构性和定量关联，表明NETs可能作为微凝块的组成成分，增强其稳定性并导致纤溶抵抗。这一发现为LC提供了潜在的生物标志物组合（微凝块+NETs标志物），并为靶向血栓炎症的治疗策略（如NETs抑制或纤溶增强）提供了理论依据。未来需在更大队列和疾病对照中验证其特异性。