利用体内自组装siRNA沉默肌抑素（MSTN）以抵抗癌症和地塞米松诱导的肌肉萎缩

　　本研究开发了一种基于合成生物学的创新策略，通过体内自组装siRNA（IVSA-siRNA）靶向沉默肌抑素（MSTN），并利用肌肉特异性肽（MSP）标记的小胞外囊泡（sEV）实现高效、特异性肌肉靶向递送。该方法在癌症和地塞米松（Dex）诱导的肌肉萎缩模型中显著恢复肌肉质量和功能，为肌肉萎缩疾病提供了安全、高效的潜在治疗新方案。

　　

1 引言

骨骼肌萎缩是一种由遗传、慢性疾病（如糖尿病和癌症）、肌肉废用、药物滥用和衰老等因素引起的病理性状况，严重影响患者的生活质量。目前临床缺乏有效治疗手段，运动干预虽有效但患者依从性差。肌抑素（MSTN）作为肌肉生长的负调控因子，其抑制被视为治疗肌肉萎缩的重要策略。然而，传统RNA干扰（RNAi）疗法存在递送效率低、组织靶向性差、生产成本高和潜在毒性等问题。因此，开发新型靶向递送系统具有重要临床意义。

2.1 靶向肌肉MSTN的合成构建体设计

研究团队设计了一种名为CMV-MSP-siR^MSTN的合成构建体，包含三个功能模块：CMV启动子模块驱动MSTN-siRNA和相关组件转录；肌肉靶向模块通过将肌肉特异性肽（MSP）与溶酶体相关膜蛋白2B（Lamp2b）融合，实现sEV膜表面展示，增强肌肉靶向能力；siRNA表达骨架模块将MSTN-siRNA嵌入前体miR-155骨架，促进sEV分泌并减少副链产生，提高特异性。该构建体通过尾静脉注射后，利用宿主肝脏作为组织底盘，在肝细胞内表达MSP-Lamp2b融合蛋白和MSTN-siRNA，组装成MSP标记的sEV并分泌入血，实现肌肉特异性递送。

2.2 沉默MSTN的合成构建物体外表征

研究人员设计了四个靶向MSTN开放阅读框（ORF）不同位点的CMV-MSP-siR^MSTN构建体，并以表达乱序RNA的CMV-MSP-scrR作为对照。在转染表达MSTN-GFP的HEK293T细胞和C2C12肌管中，所有CMV-MSP-siR^MSTN构建体均能有效产生成熟MSTN-siRNA，显著抑制MSTN蛋白和mRNA表达，其中CMV-MSP-siR^MSTN-4沉默效率最高。转染该构建体后，C2C12肌管直径显著增加，证实其可调控肌细胞形态。

2.3 产生sEV包裹的MSTN-siRNA的合成构建体离体表征

通过尾静脉注射PBS、CMV-MSP-scrR、CMV-siR^MSTN或CMV-MSP-siR^MSTN至C57BL/6J小鼠，每两天一次共七次，分离血清sEV进行表征。纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电镜（TEM）显示sEV尺寸分布一致（约124纳米），且表达经典标志物Alix、CD9和CD63。注射后6小时肝脏中MSTN-siRNA积累达峰值，血清sEV中siRNA水平在9小时最高，48小时恢复基线。RNase保护实验证实sEV脂质双层可保护siRNA免于降解。将分离的sEV与C2C12肌管共培养后，MSTN蛋白和mRNA水平显著降低，肌管直径增加。

2.4 体内追踪sEV包裹的MSTN-siRNA向骨骼肌的递送

利用PKH26染料标记血清sEV并注射至新小鼠，发现CMV-MSP-siR^MSTN组在股四头肌（Qua）、腓肠肌（Gas）和胫骨前肌（TA）中荧光积累显著。miRNAscope原位杂交技术检测到TA肌肉中MSTN-siRNA信号，其绝对水平约30皮摩尔每克总RNA。在GFP转基因小鼠中，尾静脉注射CMV-MSP-siR^GFP构建体可显著降低多块骨骼肌中GFP荧光，而脂质纳米颗粒（LNP）全身递送无此效果，局部注射仅影响注射部位。这表明IVSA-siRNA系统可实现全身给药后的多肌肉靶向。

2.5 IVSA-siRNA靶向MSTN对肌肉质量的调控作用评估

野生型C57BL/6J小鼠每两天注射5毫克每千克构建体，持续两周。CMV-MSP-siR^MSTN处理组体重、握力和TA肌肉重量与长度比值显著增加，后肢肌肉尺寸增大。层粘连蛋白免疫荧光染色显示腓肠肌和TA肌肉横截面积（CSA）显著增大。Western blot和定量RT-PCR分析表明TA肌肉中MSTN蛋白和mRNA水平及其下游效应因子MuRF1和Atrogin1表达显著降低。免疫组化染色进一步证实MSTN蛋白减少。

2.6 IVSA-siRNA靶向MSTN在癌症诱导肌肉萎缩模型中的治疗效果评估

通过皮下接种Lewis肺癌（LLC）细胞建立癌症恶病质模型，注射构建体三周后评估。CMV-MSP-siR^MSTN处理组无瘤体重、握力和TA重量显著增加，后肢肌肉萎缩明显缓解。肌肉纤维CSA恢复至接近健康对照组水平。MSTN蛋白和mRNA水平以及MuRF1和Atrogin1表达显著降低，免疫组化显示MSTN蛋白减少与健康组相似。

2.7 IVSA-siRNA靶向MSTN在地塞米松诱导肌肉萎缩模型中的治疗效果评估

通过腹腔注射地塞米松（Dex）25毫克每千克连续7天建立肌肉萎缩模型，随后注射构建体六次。CMV-MSP-siR^MSTN处理缓解了Dex引起的体重下降，握力和TA重量显著改善，后肢肌肉萎缩减轻。肌肉纤维CSA增大，MSTN蛋白和mRNA水平及MuRF1和Atrogin1表达显著降低。

2.8 IVSA-siRNA靶向MSTN的毒性和安全性评估

小鼠注射构建体七次后，检测外周血生化指标（ALT、AST、ALB、TBIL、LDH、CREA、BUN）和血细胞计数（RBC、WBC、PLT）均无显著差异。肝脏、肺、肾脏和脾脏组织学检查未发现明显损伤，表明该合成构建体无毒且生物相容性高。

3 讨论

本研究开发的合成生物学策略利用宿主内源性miRNA组装和sEV运输机制，实现siRNA向骨骼肌的高效递送。与传统LNP或细胞培养来源sEV相比，IVSA系统可通过全身给药实现多肌肉广泛基因沉默，避免局部注射局限。系统利用宿主自主产生治疗性sEV，省去分离纯化步骤，降低免疫原性风险。研究同时指出若干局限性：MSP标记sEV的细胞摄取和胞内运输机制不明；sEV在肝、肺、肾等器官也有分布，但MSTN表达主要限于骨骼肌和心肌，且MSP增强骨骼肌靶向而不影响心脏，因此功能沉默效应仍局限于骨骼肌；剂量反应关系未完全明确；需在大型动物模型中进行临床前验证。

4 实验模型和受试细节

使用C57BL/6J和GFP转基因小鼠，所有程序符合南京大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南（批准号IACUC-2410002-2）。合成构建体由GenScript合成，通过尾静脉注射裸DNA质粒。sEV通过差速离心从血清中分离，并通过NTA、TEM和Western blot进行表征。细胞实验使用HEK293T和C2C12细胞，通过Lipofectamine 2000转染。功能评估包括握力测试、组织学分析、Western blot、定量RT-PCR、免疫荧光和免疫组化。安全性通过生化指标、血细胞计数和组织学评估。数据分析使用GraphPad Prism 8软件，采用单因素ANOVA和Bonferroni多重比较检验。