综述：用于人眼角膜生物工程的3D打印策略

　　本综述系统探讨了3D打印技术在角膜组织工程中的应用，聚焦于如何通过材料选择（如GelMA、胶原）和打印策略（ME、DLP等）复制天然角膜的力学性能（115–520 kPa杨氏模量）、光学特性（>90%透明度）及曲率结构，旨在解决全球角膜供体短缺问题，为开发临床适用的生物工程角膜提供新见解。

　　

角膜结构与独特生物力学特性

角膜作为眼睛前部的透明穹顶状组织，承担着保护眼球和折射光线的双重功能。其结构分为五层：上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中基质层最厚，约占角膜厚度的90%，主要由I型和V型胶原纤维（直径约30 nm）和角膜细胞构成。胶原纤维呈层状排列，每层厚度1.5–2.5 μm，共约200层，相邻层纤维方向正交，形成类似胶合板的“正交板层结构”。这种高度有序的排列是角膜透明（可见光透过率90%）和力学性能（杨氏模量115–520 kPa）的基础。前部基质纤维排列更各向同性且密度较高，中后部则更有序但密度较低，形成刚度梯度以维持角膜的穹顶形状。

当前3D打印角膜的研究进展

分析33篇已发表论文显示，79.4%的研究聚焦于基质层再生。最常用的打印技术是材料挤出（ME，73.5%），其次是数字光处理（DLP，14.7%）、喷墨打印（8.8%）和立体光刻（SLA，2.9%）。使用最多的生物材料是明胶（14次）、胶原（13次）、透明质酸（HA，5次）和纤维素（2次）。

曲率

曲率是影响光折射、眼压分布和机械稳定性的关键结构因素。其凸几何提供眼睛大部分屈光力（约43屈光度），并通过表面张力和基底应变变化影响细胞行为。曲率较大的区域诱导细胞粘附增加并促进伸长形态，而较平坦区域支持更圆形细胞形态。曲面制造对逐层加工具有固有挑战。在33项研究中，仅13项制造了弯曲几何结构，且大多需要支撑结构。制造弯曲基质结构的方法可分为模具辅助制造和直接打印两类。

模具辅助法常与ME结合，使用预制的凹或凸支撑结构，在其上挤出含角膜基质细胞的生物墨水并交联，成型后分离进行后处理。该方法允许高通量打印，每批可同时制造6–12个角膜。

直接打印弯曲结构受最小打印悬垂角（通常45°）限制。初始尝试主要打印平面或高曲率结构以评估生物相容性和细胞行为。倒置DLP打印通过抵消重力效应改善了弯曲结构的制造，成功打印新月形人工角膜。

力学性能

具有与天然角膜组织相似力学性能的水凝胶对于维持角膜形状和曲率至关重要。3D打印水凝胶的合适机械强度不仅增强生物相容性，还通过提供生理环境降低排斥风险。水凝胶刚度可指导细胞行为，包括粘附、迁移、增殖和分化。足够的机械鲁棒性（特别是可缝合性）对于承受外科操作而不损害结构是必要的。

杨氏模量是代表材料在外力下弹性变形抵抗力的参数。人类角膜杨氏模量在115–520 kPa之间。各种材料已用于3D打印角膜以模拟其机械强度，但尚无报道的3D打印角膜达到该范围上限。最高记录值（237 kPa）使用纤维素基材料[10%羧甲基纤维素甲基丙烯酸酯（CMCMA）和20%透明质酸-单宁酸（HATA）]。其他略高于100 kPa的配方包括打印高浓度胶原（12 mg mL^?1）、GelMA-胶原（10% GelMA/0.6%胶原）、GelMA-海藻酸钠（10% GelMA/4%海藻酸钠）和GelMA-甲基纤维素（7% GelMA/8% MC）。

纤维素基材料因分子间氢键产生高度有序紧密结合的晶体网络而具有更高强度，但亲水性较低。胶原是天然角膜主要结构蛋白，提供机械强度和支持性细胞外环境。GelMA保留与胶原的结构相似性。研究表明增加生物材料浓度可提高打印结构强度，但这些材料有其固有强度极限。即使使用特定I型胶原，似乎也限制在约100 kPa。天然与3D打印角膜间的机械强度差距很可能源于纤维排列，当前研究很少讨论。需要其他方法进一步提高打印结构机械强度。

透明度

功能性角膜必须在可见光谱（400–700 nm）保持高光学透明度，同时提供UV保护。实现3D打印角膜结构最佳透明度需要精确控制胶原纤维排列、折射率匹配和细胞组成。基质层在光传输中起主导作用。

入射光与胶原原纤维相互作用产生次级球面波，相长干涉形成前向柱面波。原纤维直径或间距不规则增加后向辐射，导致光散射和透明度降低。其他影响因素包括胶原与周围细胞外基质间的折射率对比、入射光角和次级波方向。

透明度通常通过将打印结构置于印刷文本或网格上视觉检查清晰度评估。定量测量需要分光光度分析以确定不同波长下的光透射率，同时考虑吸收和散射效应。

不同研究的透明度值表明，使用胶原-IV（12 mg mL^?1）打印的结构显示出最高光学清晰度，可见光谱超过97%。胶原-I（12 mg mL^?1）、HA-DA（30%）、DECM（2%）和HAMA（10%）在较长波长也达到90%以上透明度。相反，PVA（13%）表现出显著较低的透明度（所有波长约62%）。明胶基配方透明度因组成而异；例如10% GelMA/2%海藻酸钠在700 nm达97.3%，而10% GelMA单独仅88.68%。纳米纤维素基结构（80%纳米纤维素/20%海藻酸钠）也显示良好透明度（700 nm约98.91%）。

尽管胶原和明胶基水凝胶表现出优异光学性能，它们通常需要额外修饰以增强机械性能。研究发现增加生物墨水中的生物材料浓度可提高机械强度，但实现最佳透明度和生物力学性能仍是挑战。胶原原纤维排列和折射率匹配的进一步优化可能增强3D打印角膜的光学性能。

未充分报道的关键角膜特性

尽管大多数3D打印角膜研究评估了机械强度和透明度，一些其他生物力学特性未被充分报道。屈光力表示角膜的聚焦能力，由所用材料和结构整体曲率决定。材料折射率直接影响光折射，因此将3D打印角膜的折射率与天然组织匹配对于最小化眩光、散射和光学像差至关重要。测量折射率的常用方法包括临界角法、浸没法、空心锐棱镜法和阿贝折射法。已报道的3D打印材料折射率为GelMA 1.387、I型和III型胶原1.3451–1.3552、HA-多巴胺1.343。人类角膜整体平均折射率为1.376，贡献43屈光度角膜屈光力。但很少有研究提供打印结构折射率或屈光力的全面数据。

另一个常被忽略的参数是角膜渗透性。天然角膜依靠从泪膜和房水的氧气被动扩散以及葡萄糖传输维持代谢活动。房水平均氧张力约24.1 mmHg，而角膜-大气界面开眼条件下约155 mmHg，闭眼条件下睑结膜来源约61.5 mmHg。需氧呼吸和防止角膜肿胀所需的最低前角膜氧浓度为10%（约74 mmHg氧张力）。较低氧水平可能导致感觉减退、酸中毒、上皮微囊肿、基质和上皮变薄、内皮多形性增加、缺氧诱导角膜细胞活化、基质纤维化和透明度丧失，而过度渗透性可能损害结构的机械和光学完整性。因此，用于生物制造角膜的材料必须具有足够的渗透性以促进氧气（49.2 × 10^?11 (cm²s^?1) [mL O₂·cm^?3 mmHg^?1]）、葡萄糖（3.0 ± 0.2×10^?6 cm²s^?1）和其他必需营养物的扩散。这方面在当前研究中大多未探索，是未来研究的关键领域。

3D打印的制造挑战

尽管许多研究报道了机械强度和透明度等关键特性，3D打印角膜结构的性能标准化仍不一致。许多论文通过拉伸或压缩测试提供杨氏模量数据，通过UV-vis分光光度计提供光透射率数据，但几个关键参数——包括屈光力、折射率和角膜渗透性——很少被报道。例如，尽管折射率测量对于定义角膜聚焦能力和确保光学保真度至关重要，仅少数研究报道了他们所用材料的这些值。类似地，打印结构对氧气和葡萄糖的渗透性对于维持细胞活力和代谢活动至关重要，但未得到一致解决。这种标准化表征的缺乏阻碍了研究间的直接比较和临床可行结构的进展。

先前章节强调了同时实现高机械强度和最佳透明度的困难。一个影响因素是天然人角膜由高度有序、正交排列的纤维胶原结构组成。这种有序胶原网络对于光学清晰度和生物力学性能都至关重要。相比之下，当前3D打印技术尚未实现这种精确的纤维排列。例如，传统挤出打印通常导致胶原纤维随机分布，增加光散射并降低透明度。此外，仅增加主要生物墨水成分浓度或加入PEGDA、海藻酸钠或纤维素等增强剂的策略仅使生物工程角膜的机械强度略有改善。这些方法通常缺乏有组织的纤维结构，限制了它们复制天然角膜组织机械弹性的能力，并削弱了承受生理力（如眼压和外部机械应力）的能力。为增强机械强度，一些研究在水凝胶中引入了定向微结构。这些策略通过排列纤维作为水凝胶基质中的承重元素来增强各向异性力学性能，显著提高对齐方向的拉伸强度，但工程与天然角膜组织间仍存在差距。

3D打印角膜结构的另一个主要挑战是在不依赖外部支撑材料的情况下制造自然弯曲的基质结构。人类角膜呈现对于光折射和视觉敏锐度必需的穹顶状曲率。然而，大多数当前3D打印技术依赖于平坦或支架支持的打印，在尝试制造弯曲结构时可能导致结构不一致。支撑材料的使用常常使打印过程复杂化，需要额外的后处理步骤进行移除，这可能损害整体结构完整性和层间粘附。能够实现自由形式、无支撑弯曲制造的替代打印策略对于克服这些限制至关重要。几种先进的3D打印技术可能提供解决方法。

3D打印中的先进技术

过去三年，3D打印的突破 dramatically 推进了组织工程领域。这些创新导致了新技术的发展，如超声辅助打印、磁场辅助打印、体积加法制造（VAM）和连续液体界面生产（CLIP）。这些最新进展预计在克服复制天然角膜结构保真度的长期挑战中发挥关键作用，最终为所需功能铺平道路。

3D打印角膜中精确纤维排列的先进策略

复制天然角膜基质需要精确控制胶原纤维沉积和排列。超声辅助胶原取向和磁场辅助打印等技术在这方面具有显著前景。

超声打印使用聚焦超声波形成目标图案，触发声化学聚合。这种方法允许使用热固化热固性材料，这在传统光或热诱导聚合中具有挑战性。因此，超声辅助打印扩展了生物相容性生物材料的范围，具有制造具有集成生物传感功能的角膜移植物的潜力。同时，它还克服了原位深层打印的限制，特别是当生物墨水含有高散射颗粒时，通过促进非侵入性、远程控制沉积实现。此外，声波可以在打印过程中调节气液界面，从而增强结构分辨率 and 制造速度。通过动态调整打印头内的压力，可以精确控制气液打印边界的曲率和位置，提高打印分辨率和速度，并最小化悬浮细胞或其他颗粒的散射和光吸收。此外，气液界面处的声驻波可产生周期性压力场，诱导悬浮颗粒或细胞在定义节点位置排列和聚集。当应用于含胶原分子或原纤维的生物墨水时，这些压力节点可引导它们沿特定方向取向，促进各向异性纤维排列。这种排列模仿天然角膜基质的有序胶原结构，从而改善打印结构的机械和光学性能，这两者对于工程功能角膜组织都至关重要。

磁力是另一种用于辅助引导细胞或生物材料特定方向的外部刺激。当磁性纳米颗粒（如氧化铁基）混合到生物墨水中时，它们能够在外部磁场影响下形成各向异性、对齐结构。这些纳米颗粒通过沿磁力线取向响应磁场，从而物理指导周围基质成分的分布。在含有胶原的复合水凝胶中，嵌入纳米颗粒的磁性排列可通过机械束缚或纳米颗粒-胶原相互作用的磁性操纵影响胶原原纤维的取向。该过程导致对齐的胶原微观结构，更好地复制天然角膜基质的板层结构。此外，施加的磁场诱导远程、非接触磁机械刺激，可影响封装细胞的细胞外基质和细胞骨架组织。这种机械输入促进细胞排列并激活参与角膜组织发育的机械转导通路。

无支撑弯曲角膜结构的策略

除了纤维排列，能够实现无支撑弯曲制造的自由形式打印策略对于创建解剖学准确的角膜结构至关重要。超声辅助打印、体积加法制造（VAM）和Xolography等技术作为有前景的解决方案正在涌现。

VAM于2017年由Shusteff等首次报道，使用两个或多个光束的叠加固化树脂。后来，Kelly等改进系统为断层VAM，现被广泛采用，因为它能够制造悬垂和跨越几何结构而无需支撑。通过消除对外部支撑的需求，VAM解决了与表面质量差和机械性能方向差异相关的问题。此外，它能够在打印部件上以最小机械应力打印外部组件。VAM在角膜打印中最有前景的应用之一是消除相邻角膜层间界面相关的不一致性。通过实现多层组织的同时体积制造，VAM解决了与多层角膜结构相关的组装挑战，确保机械稳定性和光学清晰度。VAM也适用于胶原基制造，类似于明胶基甲基丙烯酰胺在低温下具有高粘度并在特定波长光下通过混合光引发剂可交联。这种适应将允许使用VAM生产具有受控微结构和最小界面缺陷的胶原丰富结构。此外，由于VAM在没有物理挤压的情况下操作，它避免了剪切诱导损伤，这对于保存胶原原纤维的天然结构特别有益。

尽管有其优势，VAM在单一制造室内精确多材料沉积面临挑战。多材料打印不仅促进各种生物材料的共沉积，还实现多模态传感能力，包括拉伸、压缩、剪切、扭转和光刺激。鉴于人角膜的复杂机械和光学刺激响应，多材料打印策略对于制造功能性生物工程角膜至关重要。注射连续液体界面生产（iCLIP）可能满足多材料要求，利用微流体通道连续馈送生物墨水到打印界面。这种方法支持高通量、连续多材料打印，并在单一步骤中制造全厚度、多层角膜结构具有巨大潜力。

通过整合这些先进的3D打印策略，未来研究可能克服角膜生物制造中的现有限制。开发临床可行、全厚度人工角膜，紧密模仿天然组织的结构、生物力学和光学特性，代表了眼组织工程的下一个前沿。这些技术创新在弥合当前实验室研究与现实临床应用之间的差距方面至关重要，最终为角膜组织工程和移植带来可扩展的解决方案。 collectively，这些进展为未来开发全功能、患者特异性角膜移植提供了坚实基础。

展望与机遇

全球角膜供体短缺限制了角膜移植手术数量，导致等待时间延长，有时甚至不可逆视力丧失。应对这一挑战需要开发能够复制天然组织结构、机械和光学特性的生物工程角膜替代品。3D打印作为一种新兴技术，提供对组织维度、组织和细胞-细胞及细胞-基质相互作用的精确控制，使其成为角膜组织工程的高度有前景的方法。这种能力对于制造各向异性和结构复杂的多组织构造特别相关。

3D打印角膜结构发展的一个关键方面是增强机械性能，因为天然角膜组织必须同时提供光学清晰度和足够的生物力学稳定性。生物墨水配方和打印技术的最新进展已展示显著潜力，并且生物材料封装细胞的功能和行为已被广泛观察和研究。随着细胞封装相关挑战 largely 解决，下一个关键步骤是复制天然角膜的机械性能。建立适当的生物力学环境对于指导细胞行为和确保3D打印角膜结构的长期功能性能至关重要。尽管在再现宏观结构方面取得了显著进展，胶原原纤维的分层组织仍需要进一步优化。实现交织、正交排列的胶原纤维对于复制天然组织的生物力学和光学特性是必要的。传统逐层制造可能有限能力排列打印纤维。新兴技术，如体积打印、iCLIP和超声诱导细胞及胶原排列，可能 assist 以快速、混合材料应用和模式控制的方式提供有前景的方法来模仿天然基质结构。

为了进一步解决水凝胶基生物墨水的固有弱点，研究人员探索了几种策略。一种有前景的方法涉及在水凝胶系统中引入多个物理和化学交联机制。例如，通过结合离子和共价键进行双重交联可以在保持灵活性的同时提供改进的刚度和耐久性。超分子相互作用，如主客体组装或氢键，也被用于生成可逆物理网络以增强韧性和自恢复。并行地，酶交联方法提供生物相容性和可调节的凝胶化控制，进一步有助于结构增强。除了原位交联策略，还提出了打印后增强处理以在不损害形状保真度的情况下加强打印结构。使用UV或可见光的光交联被广泛应用以在沉积后收紧聚合物网络，从而改善承载能力。使用交联剂（如京尼平或碳二亚胺基化合物）的化学处理已显示可进一步硬化含胶原或明胶的水凝胶。此外，物理增强方法，如脱水或冻融循环，可以压缩聚合物链并增加机械完整性。

尽管这些增强方法可以显著改善机械性能，一些与潜在缺点相关，包括残留交联剂的细胞毒性效应或在严酷处理过程中对封装细胞的损伤。对于细胞活力和透明度至关重要的角膜应用，依赖于内在结构设计或生物重塑的策略可能更合适。细胞介导的重塑，其中封装的角膜细胞或干细胞在延长培养中沉积细胞外基质，已被提出作为逐渐增加组织强度同时保存细胞活力和光学清晰度的手段。类似方法在其他软组织工程应用中已成功，为未来角膜生物制造提供了有前景的途径。

此外，打印中空弯曲穹顶结构用于角膜再生仍然具有挑战性，因为曲率放大了逐层和投影-based 制造的固有限制。在逐层挤出（ME）中，角膜表面通过离散沉积路径近似，产生弦或“阶梯”误差，随着层厚度和局部斜率增加而增加。因此，陡坡和悬垂显示与设计半径的较大偏差，并且容易下垂或坍塌，除非被支撑或模制。与曲率相互作用的材料因素包括生物流变学（粘度、剪切稀化）、凝胶化/溶胶-凝胶动力学和表面张力；慢凝胶化或低屈服应力增加沉积期间和之后立即变形的风险，而过高粘度可能损害长丝连续性和分辨率。在光基打印中，如DLP打印，投影光的扩散可能导致过度固化，导致壁更厚和精细曲率细节丢失。缺乏内部支撑使得结构稳定性难以保持，并且树脂截留或水蒸发翘曲可能改变壁厚。在此类设计中保持尺寸精度仍然是 significant 技术障碍，需要仔细控制层厚度、构建方向、支撑策略和曝光设置以接近预期几何形状。

尽管存在这些已知问题，已发表研究很少报告定量几何度量。据我们所知，尚无研究系统报告此类结构中作为曲率函数的测量几何误差（例如半径或厚度偏差）。包含这些数据将大大加强分析。例如，打印一系列具有受控打印参数的测试穹顶并通过高分辨率扫描或光学相干断层扫描测量它们的实际轮廓将允许关联曲率角与尺寸误差。关键度量应包括半径误差、局部壁厚变化、表面粗糙度和地形弦误差。纳入打印几何形状的经验测量将为未来角膜支架制造和设计优化提供具体指导。此外，提出模拟模型将 great 以最小化努力，调整打印参数并实现光固化材料的高精度DLP打印。

除了机械强度 and 结构保真度，其他关键特性，如屈光力和氧气/营养渗透性，也是角膜的关键生物力学特性，尚未得到解决。我们倡导一个标准化报告系统，不仅包括生物相容性测试，还包括机械强度、透明度、屈光力和氧渗透性的定量评估。建立此类标准将实现研究间的有效比较并加速临床可行生物工程角膜的开发。

总之，虽然3D打印在角膜组织工程中取得了显著进展，需要进一步研究以 refine 纤维组织、增强机械鲁棒性并全面评估所有关键生物力学特性。多模式交联机制与打印后增强策略的整合代表了一条有前景的途径，以实现人角膜机械要求的复制。未来工作应聚焦于平衡机械增强和光学透明度之间的权衡，因为过度交联或纳米材料负载可能损害光传输。通过应对这些挑战，该领域可以更接近实现患者特异性、全厚度角膜移植，为恢复视力提供可扩展、快速和成本效益的解决方案。

为弥合这一差距，我们应提出并开发一个全面、标准化的3D打印角膜表征协议。此类协议应至少包括机械性能（例如杨氏模量）、光学透明度、折射率、屈光力和渗透性的评估。建立统一评估标准将促进研究间更有意义的比较并加速3D打印角膜结构转化为临床应用。