牙周炎母亲及其高危子代的龈下宿主-微生物互作全景：蛋白质组与微生物组关联研究

　　本文通过整合龈沟液（GCF）蛋白质组（DIA-PASEF技术）与龈下微生物组（16S rRNA测序）数据，揭示了牙周炎母亲及其子女的龈下微环境中宿主炎症反应（如补体通路激活）与微生物毒力因子（如gingipain）的早期互作特征，为家族性牙周病风险预警提供了分子依据。

　　

1 引言

牙周炎是一种多因素疾病，涉及宿主免疫炎症反应与失调的多微生物生物膜之间的复杂动态关系。它是过去十年中第二常见的口腔疾病和第六常见的健康问题。尽管吸烟和糖尿病控制不佳等因素可增加疾病进展风险，但部分个体即使缺乏局部和系统性风险因素，仍表现出更快的牙周炎进展和牙齿破坏速度。因此，牙周炎可能早期显现，患者在相对年轻时即经历晚期疾病的并发症，影响其整体健康和生活质量。

牙周炎的一个重要特征是病例的家庭聚集性，这一模式在文献中 consistently 被报道。不论是否存在共享的遗传特征或易感因素，研究一致表明，患有牙周炎的父母的孩子可被视为发生牙周病的高风险人群。类似模式在受影响个体的家庭中被观察到，与牙周健康父母的孩子相比，牙周炎父母的孩子表现出更差的临床参数和牙周致病菌定植增加。最终，父母的牙周状况被认为影响后代的微生物定植，导致在混合牙列阶段早期即出现微生物组成的显著变化， reaffirming 家庭对微生物致病性建立的影响。

然而，由于牙周病的多因素性质，仍不清楚哪些因素可触发导致未来附着丧失的临床表现。牙周炎的早期诊断特别具有挑战性且常被低估，因为儿童在牙科实践中很少接受牙周检查。此外，目前对牙周病相关微生物组的理解大多基于龈下多微生物群落的分类学特征，即细菌物种的鉴定，而关于微生物功能内容的证据有限。理解微生物代谢和功能特征，无论是在同一家庭内个体间独特和共享的，还是在不同牙周状况间的，对于在早期阶段识别疾病风险和易感性的功能特征至关重要。在此背景下，应用高通量现代蛋白质组学技术可通过揭示不同牙周状况间的分子模式和特征，提供疾病易感性的新生物学证据。

相应地，结合基因组数据，本研究旨在鉴定和量化牙周炎母亲及其后代龈下环境中的宿主-细菌蛋白质组。

2 材料与方法

2.1 研究人群与设计

招募了代表20个家庭的40名系统健康个体。参与者被分为四组（每组n=10）：牙周炎父母（PP）、父母对照组（PC）、牙周炎父母的子女（OP）和控制父母的子女（OC）。PP组由诊断为III/IV期、C级、广泛性牙周炎的患者组成。OP组由年龄6-12岁、第一恒磨牙和中切牙完全萌出、其父母被选入PP组的儿童组成。对照组中，PC组必须无因牙周炎导致的临床附着丧失史，牙龈沟探诊深度（PPD）<4 mm，无影像学邻间骨丧失，且至少存在20颗牙齿。OC组包括来自PC组的6-12岁儿童。为PC组选择了一位父母，但双方均无牙周炎史。

2.2 无标记定量蛋白质组学与微生物组分析

从同一部位收集龈沟液（GCF）和龈下生物膜，并为每位患者合并样本。使用PreOmics iST kit（德国）进行蛋白质制备和肽提取，样品在Evosep One液相色谱系统 coupled to a timsTOF Pro质谱仪上进行分析。肽段采用无标记定量蛋白质组学， employing 液相色谱-串联质谱（LC-MS）与数据非依赖采集（DIA）质谱。假发现率（FDR）设为≤1%。差异在倍数变化≥2且p值<0.05时被认为具有统计学显著性。

使用Qiagen MiniAmp kit（美国Valencia）分离龈下生物膜DNA。使用16S rRNA的V3–V4区域对基因组DNA进行测序。使用QIIME 2 2022.2进行生物信息学分析。针对HOMD数据库进行 taxonomy 分配。使用ANCOM-BC方法计算每个分类单元的差异丰度。生成热图以可视化不同样本组中最差异表达特征的表达水平，并评估所选物种蛋白质组谱的分布。

3 结果

3.1 临床发现

组间年龄相似（PP和PC分别为35.1±5.1 vs. 37.5±4.4；OP和OC分别为8.6±1.5 vs. 8.3±1.3）。患有牙周炎的母亲表现出比对照组更差的牙周参数，而她们的孩子的探诊出血（BOP）显著更高（p<0.05）。

3.2 龈下蛋白质组

总共鉴定出13,117个GCF蛋白质（27.5%人类蛋白质，72.3%细菌蛋白质，0.2%污染物）。维恩图描述了组间的总体蛋白质分布。共有8231个蛋白质是共享的，显示出明显的 parental 效应，因为家庭共享许多蛋白质。其中，661个是控制母亲和儿童独有的，而312个是牙周炎母亲及其子女独有的。

所有定量蛋白质的无监督层次聚类用于检查GCF蛋白质组是否能区分组别。虽然PP和PC组 visibly 可区分，但OP组在组中表现出 distinct 谱，主要与她们受影响的母亲聚类，部分与对照组聚类。

在排除污染物并减少由两个或更多肽段定量的蛋白质数据集的维度后，我们在每次比较（PP vs. PC 和 OP vs. OC）中总共获得6147个蛋白质，包括2427个人类蛋白质和3718个细菌蛋白质。在母亲比较中，共有913个（272个人类，641个细菌）蛋白质差异表达（≥2倍且p<0.05），而在儿童比较中，有562个（92个人类，470个细菌）蛋白质差异表达。

3.3 富集的宿主和细菌蛋白质

差异表达分析揭示了两次比较中GCF蛋白质组的显著差异。在所有定量蛋白质中，显著上调的丰度（log₂(FC) ≥0）代表Perio组与其各自对照组相比丰度增加，而显著下调（log₂(FC) ≤0）表示丰度减少。

在PP组中，GCF中最丰富的宿主蛋白质是“血红蛋白亚基gamma-1”，其次是炎症相关蛋白质，如“免疫球蛋白kappa可变区1D-13”、“lambda恒定区2”和“重链恒定区gamma-4”。下降最多的是“羧肽酶E”，以及FABP5、MAPKAPK2、IL-19、ICAM3和“层粘连蛋白亚基beta-3”。OP儿童表现出相似的谱，“血红蛋白亚基gamma-1”也是上调最多的，并且免疫球蛋白变体水平升高。Repetin是下调最多的蛋白质，其次是S100-P、FABP5、S100A11和calmodulin-1。

基因集富集分析（GSEA）用于评估 regulated 基因在比较中如何聚类，考虑了结果的稳健性和大量已鉴定蛋白质，使用生物过程作为功能数据库。PP组的GCF反映了炎症通路。这些通路中有许多在她们的孩子中上调，包括体液免疫反应和急性炎症。相反，表皮和皮肤发育通路在两组中均下调，表明与上皮和粘膜完整性相关的蛋白质（如OP组中的DSP、LAMC2、PPL、EVPL、KRT76和KRT78）表达减少。

蛋白质组学分析揭示了微生物群落的功能转变。在两次比较中均发现细菌蛋白质的显著差异。PP组表现出更具毒力的龈下谱。然而，OP个体表现出与致病过程相关的蛋白质水平增加。

PP组的功能特征包括CheY-P磷酸酶CheX、甘氨酸还原酶复合物组分B亚基alpha和beta、推定的脂蛋白YiaD和Lys-gingipain HG66的丰度增加。在分析相关分类单元时，我们可以识别出一些众所周知的疾病相关物种的存在，如牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和槽隙醛菌（Filifactor alocis），以及嗜麦芽密螺旋体（Treponema maltophilum）、脓肿拟杆菌（Phocaeicola abscessus）和挑剔弗雷特菌（Fretibacterium fastidiosum）。

在儿童比较中，不仅失调相关的毒力因子增加，而且上调的蛋白质 already 表现出致病特征，如主要菌毛亚基FimA和延伸因子G。相反，与最丰富蛋白质表达相关的 top 10 物种包括常见的牙周病原体，如牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）、中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）和福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）。

显著蛋白质的KEGG富集分析显示，对照组的 top 15 通路均与细菌代谢相关。患有牙周炎的母亲和儿童均显示脂酸代谢和细菌趋化性调节的上调增加，这些通路与细胞过程和细菌运动蛋白相关。

3.4 龈下微生物群落的组成

微生物组分析证实了OP组龈下部位微生物定植的改变模式。α-多样性 already 揭示，被诊断为牙周炎的儿童及其母亲与无牙周炎的母亲相比，具有更高的物种丰富度和均匀度。

非加权UniFrac度量的主坐标分析（PCoA）评估β-多样性，证明了不同组样本之间的分离聚类。在评估的四个组中观察到群落之间的差异（PP vs. PC, q值=0.0020; OP vs. OC, q值=0.0084; PP vs. OP, q值=0.0020; PC vs. OC, q值=0.0090; OP vs. PC, q值=0.0075; PP vs. OC, q值=0.0020）。

差异分类单元丰度揭示了牙周炎中病原体增加，但OP儿童 already 呈现显著差异。微生物组显示齿垢普雷沃菌（Prevotella denticola）和卟啉单胞菌HMT_277（Porphyromonas sp. HMT_277）水平增加，以及唾液链球菌（Streptococcus salivarius）减少。PP和OP组中几种病原体均升高，包括槽隙醛菌（F. alocis）、具核梭杆菌动物亚种（Fusobacterium nucleatum subsp. animalis）、挑剔弗雷特菌（F. fastidiosum）、牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis）、福赛坦氏菌（T. forsythia）和齿垢密螺旋体（Treponema denticola）。

在牙周炎组中同样增加的物种中，我们 next 为那些相同物种生成了蛋白质丰度的热图。尽管特定物种的蛋白质组学分析仍然导致许多缺失值，但可以观察到组间的视觉趋势。槽隙醛菌（F. alocis）、挑剔弗雷特菌（F. fastidiosum）和福赛坦氏菌（T. forsythia）在母亲和孩子之间表现出相似的模式，尽管强度不同。此外，齿垢密螺旋体（T. denticola）和牙髓卟啉单胞菌（P. endodontalis）在疾病中似乎更丰富，在牙周炎母亲组中显示出更高的强度。

4 讨论

应用深度蛋白质组谱分析技术，整合无标记液相色谱-串联离子迁移数据与深度神经网络，以剖析GCF的蛋白质组，可以清晰洞察参与牙周炎发展的生物学因素。我们利用这些数据，结合来自相同部位的龈下菌斑微生物组谱。在所有样本中鉴定出超过13,000个微生物和宿主蛋白质，提供了母亲及其后代龈下环境中宿主-微生物相互作用的全面视图。即使在缺乏附着丧失的情况下，这种谱也表现出疾病状态的关键特征，表明分子失调样事件 already 在临床附着丧失发生之前出现，并且这些亚临床事件可能是可靶向的。

值得注意的是，这项工作中采用的技术使我们能够鉴定出迄今为止GCF中最高数量的蛋白质。虽然最近的研究与早期努力相比发现了相当数量的蛋白质，但我们在仅考虑≥2个肽段的蛋白质后，仍鉴定出6147个蛋白质。此外，作为主要生物学来源的GCF中蛋白质的广泛覆盖为我们提供了不仅关于生物标志物，而且关于该环境中 ongoing 过程的信息，从而增强了我们对该人群中牙周炎发病机制的理解。

患有严重和广泛性牙周炎父母的后代被认为具有增加的发生该疾病的易感性，不仅由于风险因素的积累，如遗传学、家庭习惯和改变的口腔定植，而且还由于反复观察到与对照组相比探诊出血增加，这一发现在本研究中也得到证实。人类蛋白质丰度分析表明，母亲的牙周状况影响龈下蛋白质型。与她们受影响的母亲一样，风险儿童表现出补体通路蛋白质（C8、C7、C1r、C2、C4-B、C4-A、C3、C1q）和调节因子（I和H）水平升高，以及参与体液免疫的蛋白质。失调的中性粒细胞介导的免疫是牙周炎中组织破坏的已知风险因素，并且补体蛋白表达增加与牙周炎模型相关。局部C3抑制已被证明可以修改GCF渗出组，逆转牙周失调和炎症。这表明OP组中补体蛋白表达升高可能反映了导致牙槽骨吸收的早期事件。

相反，PP和OP个体中上皮屏障相关通路的下调可能表明口腔屏障处牙周稳态的破坏。其他无标记定量蛋白质组学研究报道了这些蛋白质的类似减少，将牙周炎与细胞连接蛋白表达降低联系起来。有趣的是，发现白细胞介素19（IL-19）在牙周炎患者中低约4倍。我们小组先前的结果支持这一观察，显示从III/IV期、C级牙周炎患者收获的牙龈成纤维细胞在伴放线聚集杆菌（A. actinomycetemcomitans）蛋白质提取物刺激下，与健康对照组相比，产生更低水平的IL-19。这些发现可能表明IL-19缺陷与受损的局部抗菌和抗炎反应之间存在关系。

上皮屏障蛋白通过允许有益分子通过同时阻挡病原体来维持组织稳态。PP和OP组中与皮肤和表皮发育相关通路的下调表明牙龈屏障维护受损。一项体外研究表明，龈下生物膜刺激降低了桥粒、粘附连接和间隙连接的表达，所有这些在我们对受影响母亲和孩子的分析中也显著减少。这些结果表明，牙龈屏障破坏与宿主对失调生物膜的反应密切相关。我们的发现强化了这种联系，显示即使在OP儿童中，牙周病原体和毒力相关蛋白质水平升高，表明组织脆弱性和潜在细菌入侵的早期分子迹象。

在这个方向上，我们通过蛋白质组学分析鉴定的细菌蛋白质基因成功地证实了先前的高通量发现， reaffirming 红色复合体物种在 orchestrate 牙周炎功能谱方面的影响。重要的是要注意，先前的一项研究表明，健康部位红色复合体毒力基因的上调与后来牙周炎的发展有关，为我们的发现关于牙周炎母亲的孩子群体增加了另一个“危险信号”。有趣的是，我们还观察到未培养的糖菌门（Saccharibacteria）（TM7）HMT_356在PP和OP组中均丰富，这与牙周炎相关。另一方面，我们在OC组中发现了其他丰富的糖菌门物种，如HMT-957和HMT-369，表明这些分类单元可能作为人类口腔微生物组的共生成员。此外，在该组中鉴定出其他共生细菌，如放线菌属（Actinomyces sp.），一种与健康口腔微生物组相关的宿主相关细菌，以及唾液链球菌（S. salivarius），一种以其抑制口腔病原体生长和调节炎症介质作用而闻名的革兰氏阳性成员。

牙周病原体，包括红色复合体、中间普雷沃菌（P. intermedia）和挑剔弗雷特菌（F. fastidiosum），在样本和牙周炎的功能分析中显示出显著更高的丰度，证实了先前关于毒力增加的证据。例如，槽隙醛菌（F. alocis）已被识别在一个与青少年未来骨丢失风险相关的联盟中，它在龈下生物膜的结构形成中扮演重要角色，并表达 significant 毒素，突出了其对未来在这些儿童中建立失调致病群落的潜在贡献。此外，必须强调密螺旋体属（Treponema）物种在微生物组和蛋白质组分析中丰度贡献的增加，在PP和OP组中细菌蛋白质的倍数变化最高，因为研究显示了它们在疾病中的重要作用；先前的研究发现，龈下密螺旋体水平降低及其相关蛋白质的下调与牙周治疗后相关。

易感儿童的 altered 蛋白质组谱在分析细菌KEGG通路富集时变得更加明显，细菌趋化性通路显示出最高的倍数变化。有趣的是，最近的一项研究也在元基因组分析中将此通路识别为在III期、C级牙周炎患者中与牙周健康个体相比显著富集，表明这些患者龈下微生物群落可能 already 向更具毒力的状态转变，并 reaffirming 该人群的高疾病风险。

通过在这种双组学分析中将“它们是谁”与“它们做什么”对齐，我们强调了红色复合体细菌和新出现的病原体（如槽隙醛菌（F. alocis）和挑剔弗雷特菌（F. fastidiosum）的突出作用，两者都与严重牙周炎相关。鉴于它们的相关性，我们的发现表明这些病原体可能也参与易感个体的临床前疾病阶段， potentially 促进牙周炎的发生和进展。

必须强调的是，共享的易感因素，不仅包括遗传和微生物学因素，还包括行为因素，如卫生和生活习惯，可能有助于牙周健康状况。OP组的儿童与对照组相比具有更高的菌斑水平，这似乎反映了一种家庭模式，因为他们的母亲也表现出显著更高的菌斑指数和更低的教育水平，与在类似人群中先前的观察一致。因此，本研究的结果也应在家庭背景下解释。相反，我们发现对照组的家庭彼此共享更多蛋白质，主要归因于细菌蛋白质。它们中的大多数由单个肽段代表，并包括大量未表征的蛋白质。因此，我们相信这种差异可能与健康中生物膜更大的代谢活动有关。然而，这一发现的生物学解释仍然受到口腔微生物组数据库中细菌蛋白质功能注释当前限制的限制。

这项研究有一些局限性。首先，小样本量限制了发现的普遍性。此外，横断面设计不允许进行因果推断。鉴定的蛋白质应在具有不同研究设计的更大队列中进一步验证，在表观遗传背景下探索，并评估牙周炎母亲及其后代之间的可共享性。

5 结论

患有严重牙周炎母亲的子女的龈下生态位显示出早期失调特征，这些特征未来可能导致牙周炎。因此，为高风险母亲和儿童建立预防计划可能是一个关键策略。