土壤捕食者Myxococcus xanthus对铜的全局响应及其在抗生素交叉耐药性中的作用机制研究

　　本研究针对农业土壤中铜积累引发的环境挑战，探讨了铜对土壤细菌捕食者Myxococcus xanthus（M. xanthus）的转录组响应及其在抗生素交叉耐药性形成中的作用。研究人员通过比较单培养和与Sinorhizobium meliloti（S. meliloti）共培养条件下的转录组数据，鉴定出多个铜调控基因，并发现两个外排泵Cus1和Cus2在铜与四环素类抗生素的交叉耐药中发挥关键作用。该研究为理解土壤微生物在金属压力下的适应机制及抗生素耐药性的传播提供了新视角，对应对21世纪健康挑战具有重要意义。

　　

在农业生产中，铜作为杀菌剂被广泛使用，导致土壤中铜不断积累。这不仅选择了耐铜细菌，还可能促进抗生素耐药细菌的共选择，对环境健康和农业生产构成双重威胁。同时，铜作为必需微量元素，在细菌捕食者与猎物相互作用中扮演着复杂角色，但其具体机制尚不明确。

Myxococcus xanthus（M. xanthus）是一种生活在土壤中的粘细菌，以其独特的多细胞生命周期和捕食特性而闻名。它能够捕食多种微生物，包括与豆科植物共生的固氮细菌Sinorhizobium meliloti（S. meliloti）。研究表明，铜在捕食者-猎物界面积累，但其在M. xanthus捕食相互作用中的具体作用仍知之甚少。

为了解决这些问题，来自西班牙格拉纳达大学的研究团队在《Microbiological Research》上发表了最新研究成果，系统探讨了M. xanthus对铜胁迫的全局转录组响应，并揭示了其在抗生素交叉耐药性形成中的贡献。

研究人员主要运用了转录组测序(RNA-Seq)技术分析铜胁迫下的基因表达谱，通过构建基因敲除突变体进行表型验证，采用改良的Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗生素敏感性测试，并使用最低抑菌浓度(MIC)测定法评估耐药性水平。

3.1 M. xanthus单培养中的铜响应

3.1.1 铜诱导上调基因主要参与铜外排和解毒

研究发现，铜区域1(CR1)和铜区域2(CR2)中的基因以及HME-RND外排系统在铜胁迫下显著上调。CR2包含CorE调控的基因，编码多铜氧化酶(MCO)CuoB、P_1B型ATP酶CopB、外膜蛋白OmpB和一个重金属相关结构域蛋白。CorE调节子基因表现出典型的铜立即响应表达模式，早期表达达到峰值后下降。CR2中的九基因操纵子curA受CorSR控制，包括编码MCO CuoA、P_1B型ATP酶CopA、CorSR和类似Cbb3型细胞色素C氧化酶亚基III的蛋白基因，其表达随时间维持稳定，表明参与维持响应。

研究还证实了编码外排系统Cus2和Cus3的基因强烈上调，cus1和czc2基因轻微诱导。通过构建Δczc2突变体，发现该突变体在铜适应和非适应细胞中与野生型菌株存活表型相同，但在高铜浓度下社会运动性(S-motility)降低，且在铜存在下捕食能力存在缺陷，表明Czc2系统在铜存在下有助于M. xanthus的适应性。

3.1.2 下调基因揭示了CR1中可能参与铜获取的新系统和两个参与氧化还原稳态的TCS

研究发现CR1中的MXAN_0976-MXAN_0979基因簇在铜存在下下调。生物信息学分析显示MXAN_0976和MXAN_0977分别类似mbnP和mbnH，这两个伙伴基因通常在细菌中共存，称为"金属神秘对"。MbnP属于铜结合蛋白家族，MbnH是细菌双血红素细胞色素c过氧化物酶成员，位于M. xanthus的周质中。研究还发现编码P_1B型ATP酶CopC(MXAN_0979)和氯通道蛋白(MXAN_0978)的基因下调。

通过构建ΔcopC突变体，发现在铜螯合剂四硫钼酸盐(TTM)存在下，ΔcopC菌株对铜螯合 slightly more sensitive than the WT strain，表明copA和copB参与铜外排，而copC可能参与铜饥饿响应。

此外，两个类似其他细菌RegBA双组分系统(TCS)的基因簇(MXAN_6223-MXAN_6227和MXAN_6976-MXAN-6981)在铜存在下最为下调，这些TCS是高度保守的全局调控系统，控制各种能量产生和利用生物过程中的氧化还原状态。

3.1.3 氧化应激响应和铜毒性

铜进入细菌细胞后，胞质中的还原环境将Cu²⁺转化为Cu⁺，后者可参与Fenton型反应和Haber-Weiss循环，产生高活性氧物种(ROS)。铜诱导的氧化应激还可导致硫醇氧化，引起含硫醇蛋白失活和谷胱甘肽(GSH)耗竭。

转录组数据显示，编码硫氧还蛋白结构域蛋白的基因是铜诱导氧化应激的主要防御响应。MXAN_6156和MXAN_7304强烈上调，MXAN_0289、MXAN_0290、MXAN_2652和MXAN_6848轻微诱导。为缓解硫醇应激，M. xanthus还诱导编码GSH二硫键还原酶(MXAN_2318)和GSH S-转移酶(MXAN_5471)的基因，这些蛋白通常参与氧化GSH的解毒。

研究还观察到编码ROS清除酶基因的上调，如过氧化氢酶KatE(MXAN_6188)。虽然铜Fenton样反应不产生H₂O₂，但超氧化物歧化酶(由上调基因sodB和sodC编码)解毒超氧化物离子会产生H₂O₂。编码两种烷基过氧化物还原酶(AhpD和AhpC)的基因簇MXAN_1563-1564也在铜诱导应激下上调，支持过氧化氢酶还原H₂O₂和有机氢过氧化物。

3.2 M. xanthus捕食过程中的铜响应

与单培养类似，最高诱导基因是那些直接参与铜外排和解毒的基因，涉及CR1和CR2中的基因，以及编码外排系统Czc2和Cus3和铁蛋白基因MXAN_7304和MXAN_6156的基因。与单培养的FPKM值相比，大多数基因的表达不受猎物存在的显著改变，但编码Cus3外排系统的三个基因在金属存在下捕食过程中FPKM值较低。

一些基因似乎仅在捕食条件下被铜改变表达。最有趣的观察之一是在2小时后上调编码具有阳离子外排结构域蛋白和具有乙二醛氧化酶结构域蛋白的基因簇MXAN_5264-MXAN_5265。该基因簇参与金属处理，受CorE旁系同源物CorE2(MXAN_5263)调控，先前发现其被锌和镉而非铜激活。

6小时后，编码甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运系统的基因簇(MXAN_2248-2251)也在捕食过程中被铜特异性上调。甜菜碱和脯氨酸都是耐渗透压分子，该转运体的上调表明在捕食过程中维持渗透平衡的作用，在富铜环境中相互作用时更为相关。

3.3 铜对铁摄取和运输的干扰

M. xanthus在铜胁迫下铁摄取机制的表达谱揭示了铜和铁代谢之间复杂关系的迷人动态。在粘细菌捕食过程中参与铁竞争的大多数基因在2和6小时的单培养中表现出明显的下调模式，随后在10小时表达增加，表明铜的存在显著影响铁稳态。

与铜暴露期间增加铁需求的其他细菌类似，M. xanthus在铜暴露期间可能也面临更高的铁需求。此外，在捕食S. meliloti过程中铜的存在进一步改变了铁摄取基因的表达模式，转向这些机制的更早上调，表明铁竞争对M. xanthus在捕食过程中变得多么关键。

3.4 铜和抗生素共选择

由于土壤环境可能因农业中铜作为杀菌剂的使用和天然来源达到高铜浓度，研究人员研究了M. xanthus铜响应如何促进抗生素耐药基因(ARGs)的选择。

通过分析在300μM CuSO₄补充培养基中针对11种不同作用机制抗生素的细胞敏感性，结果表明在铜存在下，M. xanthus WT细胞对卡那霉素的敏感性增加，对四环素和萘啶酸也略有增加。这意味着铜即使在低于毒性水平的浓度下也能增强这些抗生素对M. xanthus的效果，表明铜与抗生素作为杀菌剂的协同效应。

研究人员研究了7个外排系统(用于交叉耐药)和2个转录调节因子(用于共调控)对抗生素耐药性的贡献，这些因子已被证明在M. xanthus中被铜诱导。通过分析铜稳态基因缺失突变体的耐药性，发现铜响应调节因子CorSR和CorE的抗生素敏感性仅与WT菌株有微小差异。

四种参与铜稳态的外排泵在抗生素耐药性中显示出更重要的作用。其中，Δczc2突变体仅对萘啶酸、莫西沙星和红霉素的耐药性略有增加。Cus1和Cus2外排泵表现出显著的铜-抗生素交叉耐药性，因为Δcus1和Δcus2菌株与WT菌株相比对四环素抗生素(多西环素、四环素和土霉素)更敏感。

一个意想不到的发现涉及高度铜诱导的Cus3泵。与Δcus2菌株相反，尽管Δcus3菌株对高铜浓度敏感，但在所 assayed的铜浓度下未显示改变的敏感性。出乎意料的是，该突变体在这些条件下对萘啶酸完全耐药。通过测定萘啶酸的最低抑菌浓度(MIC)，比较WT和Δcus3菌株在铜存在下的耐药水平，获得的MIC值分别为50和800μg/ml。

研究结论与意义

该研究揭示了M. xanthus复杂的铜响应包括异常数量的诱导元件，参与外排(两个ATP酶和四个RND型系统)、铜氧化(三个MCO)和几个铜结合蛋白和外膜蛋白。转录组数据鉴定出一个包含ATP酶CopC基因的簇，可能参与铜限制条件下的铜重新分配和/或摄取。此外，数据揭示了对氧化应激的多方面响应，主要通过几个硫氧还蛋白的激活和铁代谢的干扰来实现。

当M. xanthus在铜存在下捕食S. meliloti时，关键解毒元件的表达水平与单培养相似。然而，几个基因在铜捕食过程中选择性上调，包括来自CorE2调节子的基因、甘氨酸-甜菜碱ABC转运系统和几个金属蛋白，表明这些蛋白在捕食过程中铜管理中的作用。值得注意的是，在富铜条件下捕食过程中，主要过氧化氢酶基因katE的下调以及几个氧化应激相关基因的抑制表明M. xanthus在捕食者-猎物相互作用中的氧化应激韧性增强，由对铜和捕食的联合响应驱动。

鉴于M. xanthus中铜外排元件的丰富性以及铜与抗生素敏感性在污染环境中的 established联系，研究人员探索了潜在的交叉耐药机制。虽然需要进一步研究以 fully understand潜在机制，但Cus1和Cus2泵增加了对四环素的耐药性，而Cus3的缺失在铜存在下赋予对萘啶酸的完全耐药性。由于有报道称停止使用抗生素可能无法逆转金属驱动共选择环境中的耐药性，这项研究为哪些细菌金属响应元件可能促进抗生素耐药性传播提供了重要见解。