基于网络药理学挖掘纤溶酶原(PLG)靶点：氨甲环酸(TXA)抑制结直肠癌转移的计算机模拟与体外验证

　　本研究针对结直肠癌(CRC)转移治疗难题，通过生物信息学分析筛选出关键枢纽基因纤溶酶原(PLG)，发现其抑制剂氨甲环酸(TXA)可显著抑制SW480细胞的迁移能力。该研究为TXA的临床抗转移应用提供了理论依据，为CRC治疗提供了药物重定位新策略。

　　

结直肠癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中转移是导致治疗失败和患者死亡的主要原因。尽管近年来筛查手段不断进步，早期结直肠癌的发病率有所下降，但区域性和远处转移病例却在过去十年中持续增加。更令人担忧的是，转移性结直肠癌患者的5年生存率仅为20%左右，这一严峻现状凸显了开发新型治疗策略的紧迫性。

然而，传统的新药研发面临着重大的挑战：不仅需要投入巨额资金，还需要经历漫长的研发周期。在这种背景下，药物重定位(drug repositioning)作为一种创新策略应运而生，它通过为已有临床批准药物寻找新的治疗适应症，能够显著缩短研发时间、降低开发风险，为癌症治疗提供了一条捷径。

近期发表在《Molecular and Cellular Probes》的一项研究采用系统生物学方法，深入探索了结直肠癌转移过程中的关键分子机制，并成功通过药物重定位策略发现了一个有前景的治疗方案。研究人员通过整合生物信息学分析和体外实验验证，为结直肠癌转移的治疗提供了新的思路和实验依据。

研究人员采用多个关键技术方法开展本研究：首先从GEO数据库获取GSE131418数据集（包含878例原发肿瘤和257例转移灶样本），通过差异表达分析筛选转移相关基因；利用Cytoscape软件构建蛋白质相互作用(PPI)网络，采用CluePedia和ClueGO插件进行网络分析和功能富集；通过DrugBank数据库查询靶向枢纽基因的已批准药物；最后使用SW480细胞系，通过MTT法、划痕实验和Transwell迁移实验验证候选药物的抗迁移效果。

3.1. 转移组织中的差异表达基因

研究人员对GSE131418数据集中的878例原发结直肠肿瘤和257例转移组织（肺和肝）的表达谱进行分析，在去除2,793个组织特异性基因后，对剩余的21,702个基因进行差异表达分析。在MCC和Consortium两个数据集中分别鉴定出127个和147个差异表达基因(DEGs)。分析显示MMP1、MMP3、MUC2和LRRN4CL基因在两组数据中均具有最高的绝对logFC值。通过维恩图分析发现，两个数据集共有32个上调基因和73个下调基因是共同的，这些基因被认定为转移相关基因。

3.2. PPI和功能网络

使用105个差异表达基因构建PPI网络，经过扩展后获得包含204个节点和464条边的最终网络，其中99个节点高度互联。这些基因在细胞外基质组织通路（如胶原降解和细胞外基质降解）和癌症相关通路（如Wnt、mTOR和Rho信号通路）中显著富集。此外，这些基因还与一些代谢过程密切相关，如视黄醇代谢和糖胺聚糖生物合成过程。功能富集分析强调了这些基因在转移过程中的重要性。

3.3. 枢纽基因和药物查询

研究人员根据度中心性(Degree)、介数中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)三种网络中心性测量指标，筛选出前15%的节点作为枢纽基因候选。最终确定了25个枢纽基因，这些基因在原始网络中构成了一个局部密集社区。其中5个平均logFC大于1的枢纽基因被用于DrugBank数据库查询，发现纤溶酶原(PLG)的抑制剂氨甲环酸(TXA)和氨基己酸，以及APOE的抑制剂氯化锌和硫酸锌。由于TXA和氨基己酸比锌家族药物具有更高的特异性，且TXA对PLG的结合亲和力高于氨基己酸，因此选择PLG作为最终靶点，TXA作为候选药物进行后续分析。

3.4. PLG在结直肠癌中的关键作用

进一步研究发现PLG参与多个重要生物学过程：首先是细胞外基质组织，包括基质金属蛋白酶(MMP)的激活和细胞外基质的降解；其次是血小板活化、信号传导和聚集；第三是通过胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)调节胰岛素样生长因子(IGF)的转运和摄取。这些联系表明PLG在侵袭和转移过程中的三重事件中具有重要性：ECM重塑、血小板贡献和协作、以及为转移提供能量。

研究人员还分析了CPTAC-COAD蛋白质组学数据，发现PLG蛋白水平在IV期显著高于I期（p=0.026）。有趣的是，PLG表达水平在不同表型组间存在差异：高突变亚型具有最高的PLG水平，其次是上皮-间质转化(EMT)亚型。研究还发现PLG蛋白水平与肿瘤组织中的突变率呈正相关。

3.5. TXA对SW480细胞运动和迁移的影响

通过MTT实验确定TXA的非细胞毒性浓度，发现2.5和5 mg/ml是对细胞活力没有显著影响的最高浓度。划痕实验和迁移实验显示，TXA能显著降低SW480细胞的迁移能力。处理48小时后，对照组伤口面积平均闭合68%，而2.5和5 mg/ml TXA组分别仅闭合44%和36%。迁移实验也表明，两种浓度的TXA都能减少穿过Transwell小室的细胞数量。对照组平均迁移细胞数为594个，而2.5 mg/ml TXA组为382个，5 mg/ml TXA组为296个。研究人员还观察到，处理组中成功穿过膜的细胞呈现聚集状态，这表明TXA对集体细胞侵袭的效果较差，可能更有利于预防单细胞迁移。通过drm包拟合药物反应曲线，计算出划痕实验和迁移实验的ED₅₀值分别为3.677和4.799 mg/ml。

讨论与结论

研究表明，结直肠癌转移会恶化治疗结果，显著降低患者总生存期。虽然手术通常是可切除转移组织的首选治疗方法，但系统性药物治疗是一种更方便、非侵入性的方法。由于药物发现是一个耗时且昂贵的过程，药物重定位在过去几十年中似乎是一条更有前途的道路。

本研究发现，在转移组织与原发性肿瘤相比的差异表达基因构建的PPI网络中，这些节点（基因）在细胞外基质(ECM)组织、Wnt、Rho和mTOR信号通路中过度表征。先前的研究表明，基质重塑过程，如ECM降解，可能参与转移的任何标志。例如，它们可以影响细胞的运动性和侵袭潜力、可塑性以及在靶器官中的定植。此外，有证据表明mTOR和Rho信号通路参与上皮-间质转化(EMT)，这是癌症转移中众所周知的一步。Wnt信号通路还通过诱导干性基因表达以及Wnt与炎症相关信号（如NF-κB通路）之间的串扰，与CRC干细胞和转移相关。

研究发现PLG作为一个可药物化的枢纽基因，其酶原形式可转化为纤溶酶(Plasmin)，这是一种能够降解多种蛋白质的蛋白酶。多项研究显示了纤溶酶在不同类型癌症中的重要性。本研究发现在结直肠癌转移中，PLG通过参与三个事件发挥作用：ECM降解和重塑、促进血小板协作、通过降解IGFBP促进IGF与其受体结合。

通过体外实验探索TXA（PLG抑制剂）对SW480细胞运动性和迁移潜力的抑制效果。TXA是一种赖氨酸氨基酸衍生物，可以竞争性抑制PLG的活性，并在一些研究中被建议和测试作为抗癌药物。本研究发现TXA在体外有效降低了CRC细胞的迁移潜力，证实了计算机模拟分析的预测。然而，研究的一个重要限制是需要高剂量的TXA才能实现所需的抗迁移效果。这种高剂量在潜在副作用和临床适用性方面提出了挑战。为了克服这一缺点，需要开发和实施有效的药物递送系统。

总之，这项研究通过综合分析方法揭示了PLG在结直肠癌转移中的关键作用，并证实了TXA作为抗转移药物的潜力。研究不仅深化了对结直肠癌转移机制的理解，而且为临床治疗提供了新的可能性，尽管在药物剂量和递送系统方面仍需进一步优化。这些发现为开发针对结直肠癌转移的新型治疗策略奠定了重要基础。