综述：双重SMAD抑制作为人类多能干细胞神经科学与再生医学中的多功能平台

　　本综述系统阐述了双重SMAD抑制技术（通过同时抑制TGF-β和BMP信号通路）在高效诱导人多能干细胞（hPSCs）向神经谱系分化中的核心作用。作者详细分析了其分子机制（涉及SMAD2/3和SMAD1/5/8磷酸化的阻断），总结了该平台在构建脑区特异性神经元亚型分化方案、生成帕金森病（PD）临床移植细胞、建立疾病模型（如阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）、脊髓损伤（SCI））及人类发育研究中的突破性成就，并客观评价了其在胶质细胞生成、神经祖细胞（NPC）扩增等方面的局限性与未来整合人工智能（AI）、基因编辑（如CRISPR/Cas9）等技术的发展方向。

　　

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（hiPSCs）具有分化为人体几乎所有细胞类型的潜力，为再生医学、疾病建模和发育生物学提供了宝贵平台。早期采用胎儿中脑组织移植治疗帕金森病（PD）的成功为细胞替代疗法提供了概念验证，但该策略受限于伦理问题、供体稀缺性和组织质量差异。因此，从多能干细胞等可再生且符合伦理的来源生成功能等效细胞成为了干细胞研究的核心目标。

早期从小鼠胚胎干细胞（mESCs）通过拟胚体（EB）形成或基质细胞共培养生成神经元的方案在向人胚胎干细胞（hESCs）转化时，难以达到临床应用所需的 rigorous 标准。这主要是由于 mESCs 和 hESCs 在多能性状态上存在根本差异：mESCs 处于初始（na?ve）多能性阶段，而 hESCs 则处于primed多能性阶段，更类似于小鼠植入后阶段。使用鼠源基质细胞还存在异源污染的安全风险，凸显了开发人源特异性、无饲养层分化策略的必要性。

双重SMAD抑制在hPSCs神经元分化中的机制

双重SMAD抑制协议的引入是一个重大转折点。该策略通过同时抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）/Activin/Nodal通路，以高效率和高纯度将hPSCs导向神经外胚层命运。此协议已成为人类神经元分化的基础方案，并推动了干细胞研究的重大突破。

其机制基础源于发育生物学。胚胎发育过程中三个胚层——外胚层、中胚层和内胚层的形成，主要由WNT/β-catenin、FGF、TGF-β和BMP家族的信号通路协同作用所 orchestrate。在早期发育中，活跃的TGF-β和BMP信号通路通过维持多能性或使细胞转向中胚层和内胚层谱系来阻止神经元分化。双重SMAD抑制通过同时阻断这两条通路，消除了维持多能性和诱导中内胚层命运所必需的信号，从而使hPSCs退出多能状态，默认分化为神经外胚层谱系。

具体而言，小分子SB431542通过选择性靶向Activin受体样激酶ALK4、ALK5和ALK7来抑制TGF-β信号，从而抑制SMAD2/3活化及其下游事件。内源性BMP拮抗剂Noggin通过结合并隔离BMP配体，阻止其与BMP受体结合。此外，也常使用化学替代品，如dorsomorphin及其更有效的类似物LDN193189，通过靶向ALK2/3/6受体抑制细胞内BMP通路，从而阻断SMAD1/5/8的磷酸化。

最终结果是 robust 且可重复地诱导神经命运。双重SMAD抑制不仅抑制中内胚层分化并促进神经特化，还减弱了细胞增殖，这可能是由于失去了TGF-β信号提供的促有丝分裂输入。这有助于提高神经元群体的同质性和纯度，并最大限度地降低残留未分化细胞的风险。

成就

各类脑区特异性方案的基础

人脑由多个解剖和功能 distinct 的区域组成。在发育过程中，这些区域的特化由独特的 patterning 信号引导。双重SMAD抑制协议为后续旨在体外生成脑区特异性神经元亚型的方案奠定了基础。在没有外部模式化信号的情况下，通过双重SMAD抑制衍生的神经外胚层细胞采用默认的前脑特性，主要产生皮质神经元。

为了生成代表更靠后脑区的神经元群体，必须引入额外的模式化信号来引导祖细胞命运沿前后轴和背腹轴发展。激活WNT、FGF和视黄酸（RA）信号通路的小分子作为尾部化因子，将其 identity 转向后部神经命运。音猬因子（SHH）信号促进腹侧化，而经典WNT和BMP通路支持背侧化。

例如，将双重SMAD抑制与腹侧化SHH信号相结合，已被用于生成底板群体，这些是位于神经管腹侧中线的特殊细胞。在中脑，底板是多巴胺神经元的祖细胞。结合双重SMAD抑制、SHH以及尾部化因子（如FGF8和CHIR99021）的方案，已被证明能强力诱导中脑底板特性，其特征是共表达转录因子FOXA2和LMX1A。这些群体随后成熟为功能性的中脑多巴胺神经元，使得该策略对帕金森病研究极具价值。此外，双重SMAD抑制与其他信号分子的组合已被广泛应用于生成其他神经元亚型，如下丘脑神经元、血清素神经元和运动神经元。

用于移植研究的功能性移植物生成

基于双重SMAD抑制策略的方案已成为为移植研究生成可靠且具有临床 relevance 的移植物来源的关键平台。通过实现从hPSCs高效、可重复地诱导神经外胚层，该协议为生产用于治疗各种疾病的特定神经元亚型提供了一致的起点。

采用基于双重SMAD抑制协议的hPSC衍生细胞进行的临床试验，在帕金森病治疗方面标志着重大里程碑。两项最近的《自然》杂志研究报道了使用基于双重SMAD抑制的方案，将hPSC衍生的中脑多巴胺神经元成功用于帕金森病患者的I期临床试验。这些研究证明了移植物的存活、多巴胺生产、没有显著 adverse effects，并显示出良好的临床结果。

除了PD，双重SMAD抑制已被用于临床前研究以治疗其他疾病，如视网膜变性、肌萎缩侧索硬化（ALS）、脊髓损伤（SCI）和癫痫。例如，在视网膜变性疾病中，建立了从hiPSCs产生临床级视网膜色素上皮（RPE）细胞的全面流程，该流程结合了温和的双重SMAD和FGF抑制以增强RPE诱导。在ALS中，临床前研究将hiPSC衍生的神经干细胞（NSCs）移植到SOD1^G93A ALS大鼠的脊髓中，延迟了疾病发作，并保留了运动神经元群体。对于脊髓损伤，研究探索了移植由双重SMAD抑制衍生的运动神经元和神经嵴细胞，在动物模型中观察到行为改善。

疾病与发育建模研究

除了在生成用于移植的安全且区域特异性移植物方面的潜在应用，双重SMAD抑制协议已成为人类发育和疾病建模研究中的重要工具。通过将hPSCs导向神经外胚层命运，该协议能够在 defined 且可重复的条件下体外重建早期发育轨迹。

该协议的各种衍生方案已被用于研究神经退行性疾病的病理生理学，包括PD、ALS和亨廷顿病。例如，利用SATB1敲除（SATB1-KO）hESC系（PD的已知遗传风险因素）的研究表明，在从同一SATB1-KO系衍生的mDA神经元中选择性诱导了细胞衰老，而在皮质神经元中则没有。另一项研究将光遗传学方法纳入双重SMAD抑制衍生的mDA神经元中，以加速α-突触核蛋白积累，模拟在迟发性PD患者中观察到的与年龄相关的α-突触核蛋白积累。

该协议还促进了代谢疾病和感染性疾病的研究。一项研究使用基于双重SMAD的方案从高体重指数个体衍生下丘脑神经元，揭示了肥胖相关 signature 基因的上调和激素反应性的改变。在传染病方面，研究利用基于双重SMAD的方案证明了hPSC衍生的mDA神经元对SARS-CoV-2感染的易感性。

优势与局限性

优势

该策略的主要优势包括高效率、技术简单性（能够使用小分子精确控制细胞命运）、在二维和三维培养系统中的 versatility，以及在各种hPSC系间的可重复性。使用小分子（如dorsomorphin和SB431542）选择性靶向并抑制TGF-β和BMP信号通路，通过直接与细胞表面受体相互作用，实现了在受体水平上的 targeted 调节，防止了细胞外信号启动 divergent 细胞内级联反应，从而确保了细胞命运决定由特定的、预定义的细胞内信号事件一致驱动。

局限性

尽管有许多优点，双重SMAD抑制策略仍有改进空间。产生神经元的高纯度在需要异质细胞群的环境中可能并不理想。该协议最初主要设计用于诱导神经元分化，尚未针对胶质细胞的形成进行优化。表观遗传分析表明，NPCs在早期胚胎大脑发育过程中表现出神经源性潜能，但逐渐转变为胶质生成能力，在更晚的发育阶段首先产生星形胶质细胞，随后产生少突胶质细胞。双重SMAD抑制协议中神经元特性的快速诱导限制了NPCs获得胶质生成潜能所必需的增殖阶段。

另一个限制是几乎不存在 prolonged 增殖性NPC阶段。建立能够增殖、冷冻保存并可立即用于移植的NPC系将有助于从临床前研究向临床应用的转化。此外，该协议在 less-primed 多能细胞（如mESCs）中尚未有报道能产生可比结果，表明将其应用于初始多能细胞需要谨慎。另一个限制涉及其在模拟神经退行性疾病方面的广泛应用，许多疾病在衰老神经元中表现出迟发性特征，而双重SMAD抑制主要侧重于早期命运决定而非神经元成熟。

结语：分化策略的未来方向

在过去的16年里，双重SMAD抑制在干细胞科学中发挥了变革性作用。然而，随着领域的进展，考虑在此基础方法之上构建并解决其局限性的下一代策略将至关重要。

一个有前景的方向在于将双重SMAD抑制与脑类器官系统互补地整合。虽然双重SMAD抑制产生高产量的同质神经元群体，但类器官系统提供了更复杂的三维结构，能更好地 recapitulate 体内发育过程。这两种方法并不 mutually exclusive；相反，双重SMAD抑制策略的 versatility 使其适用于初步建立区域特异性神经元分化协议，经过 minimal 调整，这些协议可以适应三维系统以生成多区域类器官，最终实现能够 recapitulate 复杂神经回路的 assembloid 形成。

同时，人工智能（AI）和深度学习（DL）等技术进步正在重塑干细胞科学中数据的处理和解释方式。DL算法可以通过识别复杂的细胞模式、分类细胞状态、勾勒单个细胞轮廓以及跟踪活细胞成像中的动态行为，来自动化和增强基于图像的分析。这些分析能力与使用 monolayer 培养系统的双重SMAD抑制协议特别兼容，为AI-based高速成像提供了最佳条件。

尽管该方法建立已超过十年，但双重SMAD抑制的基本特征仍然高度相关，包括工业应用。超越神经科学，双重SMAD抑制 underlying 的原理——精确控制信号通路以指导细胞命运——也影响了其他细胞类型的分化策略，如心肌细胞、肝细胞、胰腺β细胞和肺上皮细胞，这标志着它对整个领域做出了范式转变的贡献。