工程菌株BHJ04-BLG4通过双重机制（杀线活性与系统抗性诱导）实现对松材线虫病的绿色防控

　　本研究通过基因工程技术将外源杀线虫基因BLG4（编码碱性丝氨酸蛋白酶）导入内生细菌Pseudomonas abietaniphila BHJ04，构建工程菌株BHJ04-BLG4。该菌株在松树茎部定殖能力强（15天达2.06×104 copies/μL），其分泌的BLG4蛋白可降解线虫体壁（IC50=35.98 μg/mL），并通过激活脱水响应蛋白（315.06倍）及几丁质酶、PR-2（β-1,3-葡聚糖酶）、PR-5（类甜蛋白）等防御基因（7.43–34.26倍）诱导系统抗性，温室防效达86.66%。该菌株对烟草、紫花苜蓿等植物无致病性，为松材线虫病（PWD）提供了安全高效的生物防治策略。

　　

Section snippets

Bacteria, plasmids, PWNs, and plant materials

Pseudomonas abietaniphila BHJ04（菌株编号：CCTCC AB 2024052）、大肠杆菌ATCC25922、伯克霍尔德菌LMG1222、铜绿假单胞菌NJ1311以及载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP保存于南京林业大学森林保护重点实验室。对于含有pBBR1MCS2-Tac-EGFP质粒的菌株，在培养基中添加卡那霉素（50 μg/mL）以维持质粒稳定性。

高毒力松材线虫（PWN）株系AMA3（分离自安徽省）保存于本实验室。将其接种于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）上，在25℃黑暗条件下培养7天以扩繁。随后使用贝曼漏斗法分离线虫，用无菌水洗涤3次后调整浓度至2000条/mL备用。

马尾松（Pinus massoniana）幼苗（2年生）购自江苏句容林场，种植于温室（25±2℃，16小时光照/8小时黑暗）。接种前平衡培养两周。

Prediction of secretion systems and identification of strain-specific genes in Pseudomonas abietaniphila BHJ04

为确认BHJ04是否能将外源蛋白分泌至植物环境，我们基于其全基因组信息（登录号CP155619），使用MacSyFinder（v2.1）和TXSScan模型（v1.1.3）在默认参数下预测了其分泌系统。结果（表S1）显示：BHJ04拥有假单胞菌属中从I型到VI型的全部分泌系统类型，涉及102个相关基因。具体而言，分别有12、10、11、30、6、25和8个基因参与T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS和T9SS的功能运作。这些完整的分泌系统为工程菌株高效分泌BLG4蛋白提供了坚实的分子基础。

Discussion and conclusions

植物内生细菌具有定殖快、迁移性强和繁殖迅速的特点，是构建基因工程菌的优异载体（Lu et al., 2007; Zhang and Song, 2012）。其定殖能力直接影响控病效果（Wei et al., 2010）。本研究表明工程菌BHJ04-BLG4能快速定殖于马尾松茎部，并在15天时达到峰值（2.06×10⁴ copies/μL）。这可能是由于其天然的内生特性与引入的外源基因协同增强了适应性。值得注意的是，工程菌在接种30天后仍能维持较高种群密度，说明其具备持续发挥生物防治功能的潜力。

BLG4作为一种碱性丝氨酸蛋白酶，能特异性降解线虫体壁蛋白质（Huang et al., 2005）。本研究通过体外实验证实：纯化的BLG4蛋白可有效破坏线虫体壁结构，其半致死浓度（IC₅₀）为35.98 μg/mL；而培养48小时的菌株粗提液上清更是实现了100%的杀线活性。这种高效杀线能力与BHJ04-BLG4携带的多种分泌系统（特别是T2SS和T5SS）密切相关，这些系统确保了BLG4蛋白的高效分泌与定向递送。

除直接杀线作用外，BHJ04-BLG4还能通过诱导系统抗性（ISR）增强宿主防御能力。RT-qPCR分析显示：接种该工程菌后，马尾松脱水响应蛋白基因表达量在48小时飙升至315.06倍；几丁质酶、PR-2（β-1,3-葡聚糖酶）和PR-5（类甜蛋白）等防御基因在24–48小时内显著上调（7.43–34.26倍）。这种"双管齐下"的机制——直接杀线虫与激活植物免疫——显著提升了温室防治效果（防效86.66%），为松材线虫病防控提供了新范式。

在安全性方面，初步生态风险评估显示BHJ04-BLG4未在烟草、紫花苜蓿或黑松上引发病害症状。这表明该工程菌在发挥生物防治功能的同时，对环境和非靶标生物具有良好相容性，符合可持续农林保护的理念。