间充质基质细胞混合培养无法真实反映供体平均特性：功能异质性与优势供体主导现象解析

　　本研究针对MSCs治疗中供体异质性导致的临床前研究可重复性差及疗效不一问题，系统探讨了混合供体MSCs培养体系的代表性。通过将9例人源MSCs按细胞活力分级构建同质/异质混合池，结合功能实验与细胞追踪技术，发现混合培养并非均衡反映供体特性，而是呈现优势供体主导现象，且功能表现与个体供体存在显著偏差。该研究强调了生物学重复的重要性，为MSCs标准化研究提供了关键实验依据。

　　

在再生医学领域，间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）因其多向分化潜能和免疫调节功能被视为最具临床应用前景的细胞类型之一。然而，MSCs研究和临床应用面临一个根本性挑战：不同供体来源的MSCs存在显著异质性，导致实验数据波动大、治疗效果不一致。为克服这一问题，研究者们常采用将多个供体的MSCs混合培养（pooling）的策略，期望通过"平均化"来减少数据变异性。但这种做法背后存在一个未被证实的假设：混合培养的细胞群体能均衡代表所有供体的特性。

实际情况可能更为复杂。已有研究表明，混合培养的MSCs在传代过程中组成会发生变化，这让人怀疑：混合培养是否真的能代表所有供体的特性？还是会被最具活力的"优势供体"所主导，从而产生偏离真实情况的实验结果？这个问题不仅关系到基础研究的可靠性，更直接影响临床治疗的标准化和疗效可预测性。

为解答这一关键问题，维也纳兽医大学的研究团队开展了系统研究，研究成果发表在《Regenerative Therapy》上。研究人员设计了一个精巧的实验方案：首先从9个人类供体获取脂肪来源的MSCs，通过种群倍增时间（PDT）、代谢活性和集落形成能力等指标评估每个供体细胞的"细胞活力"，将其分为高、中、低活力组；然后构建同活力组混合池（高活力池、中活力池、低活力池）和异质混合池（混合活力池）；最后通过功能实验和细胞追踪技术，比较混合池与单个供体细胞的表现，并监测混合池中细胞组成随时间的变化。

研究采用了几项关键技术方法：通过种群倍增实验和MTS法评估细胞增殖与代谢活性；采用三系分化诱导（成骨、成软骨、成脂）检测多向分化能力；利用划痕实验分析细胞迁移能力；通过β-半乳糖苷酶活性检测细胞衰老状况；创新性地结合荧光标记显微术（使用CellTrace Violet、Far Red和Cytopainter染料）和基因组DNA标记qPCR技术（基于hGSTT1、hSRY、RHD和TUBA1A基因多态性）双轨追踪混合池中不同供体细胞的比例变化。样本来源包括商业供应商（PromoCell）和骨科手术废弃物（经伦理批准和知情同意）。

3.1. 混合与单个培养细胞的功能特征比较

3.1.1. PDT和代谢活性

高活力组的单个供体细胞显示快速增殖，PDT短且数据变异小；代谢活性（MTS法）也最高，到第7天时显著高于低活力组（p<0.05）。虽然混合池的PDT与相应单个供体细胞的中位数高度一致，但代谢活性却出现显著偏离：高活力池的表现优于所有高活力单个供体，而混合活力池则相反，表现差于相应单个供体。

3.1.2. 三系分化

所有细胞群体均证实有多向分化潜力，但混合池的结果常常超出单个供体细胞的数据范围，且无一致性的优于或劣于趋势。特别值得注意的是，混合活力池的软骨形成能力非常有限。

3.1.3. 迁移潜能

所有细胞群体在48小时内几乎完全闭合划痕伤口，组间差异不显著。但混合池的数据再次与单个供体数据不一致，高活力组内变异小，而低活力组和混合活力组内单个供体间变异大。

3.1.4. 衰老

第4天时高活力组的衰老率显著低于低活力组（p=0.01）和中活力组（p=0.008）；到第7天差异不显著。混合池的数据大体与单个供体一致，但第7天时高活力池显示更低衰老率。

3.2. 混合池细胞组成随时间变化

荧光显微镜图像量化显示，每个标记供体的细胞比例随时间变化。到第7天，混合活力池中高活力供体细胞占44%，中活力供体占31%，低活力供体仅占25%。qPCR基因标记分析定性确认了这一趋势（高:55%、中:33%、低:12%）。有趣的是，即使在同活力组混合池中也出现优势供体现象：高活力池中优势供体占54%，低活力池中占42%（中活力池例外）。

研究表明，MSCs混合培养并不能均衡代表所有供体的特性，而是受细胞活力差异驱动，呈现优势供体主导现象。这种主导现象在功能上表现复杂：虽然高活力池在增殖方面表现优异，但混合活力池却出现代谢活性和分化潜能下降的反常现象。这意味着混合培养并非简单的"平均化"，而是引入了新的变异性。

该研究对MSCs研究领域具有重要启示：首先，它挑战了"混合培养可减少供体变异"的普遍假设，指出这种策略可能掩盖而非解决异质性问题；其次，它强调了生物学重复（使用不同供体细胞独立重复实验）而非技术重复（使用混合池分样重复）对捕捉真实生物变异的重要性；最后，它为MSCs标准化研究和临床应用提供了重要参考——混合培养策略需要更加谨慎地使用，并且需要充分考虑细胞活力差异可能带来的偏差。

研究还指出了未来研究方向：需要深入探索不同供体MSCs之间通过分泌因子和细胞接触通讯的机制，以及这些相互作用如何影响混合群体的整体行为。单细胞分析技术可能为解析这些复杂相互作用提供更深入的见解。

这项研究不仅增进了我们对MSCs生物学行为的理解，也为改进再生医学研究策略提供了实证依据，推动领域向更加可靠和可重复的方向发展。