Penfluridol通过激活AMPK诱导PD-L1泛素化降解增强结直肠癌抗肿瘤免疫

　　本研究针对结直肠癌(CRC)中免疫检查点抑制剂对微卫星稳定(MSS)型患者疗效有限的临床难题，揭示了抗精神病药物Penfluridol(PFD)通过激活AMPK通路促进PD-L1泛素化降解的新机制。研究人员通过体内外实验证实PFD可显著增强CD8+/CD4+ T细胞浸润，并与PD-1抗体产生协同抗肿瘤效应，为克服免疫治疗耐药提供了创新性联合策略。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是发病率第三的恶性肿瘤，其治疗面临严峻挑战。尽管靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Blockades, ICBs）已成为CRC治疗的有效策略，但大多数微卫星稳定（Microsatellite Stable, MSS）型患者对ICB治疗反应有限。这种治疗抵抗性与肿瘤细胞表面程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）的表达密切相关，它通过与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞活化，促进肿瘤免疫逃逸。因此，开发能够下调PD-L1表达的新型策略，对于提高ICB疗效具有重要临床意义。

在此背景下，研究人员将目光投向药物重定位（Drug Repurposing）领域。Penfluridol（PFD）是一种传统抗精神病药物，既往研究提示其在多种癌症模型中表现出抗肿瘤活性，但其在调节抗肿瘤免疫方面的作用尚未明确。发表于《Translational Oncology》的这项研究，系统阐释了PFD如何通过分子机制调控PD-L1表达，并增强T细胞介导的免疫杀伤作用，为CRC免疫治疗提供了新思路。

本研究主要采用细胞系（包括人源LoVo、SW480和小鼠MC38 CRC细胞）和MC38荷瘤小鼠模型，运用MTT法、集落形成、流式细胞术检测细胞活力和凋亡；Western blotting、qRT-PCR、膜表面PD-L1流式检测分析分子表达；放线菌素D/CHX追踪实验评估mRNA/蛋白稳定性；Co-IP验证泛素化水平；体内实验结合PD-1抗体治疗，通过免疫组化、流式细胞术分析肿瘤免疫微环境；并通过血清生化指标和组织H&E染色评估安全性。

PFD具有显著的体外抗CRC效果

研究人员通过MTT实验发现，PFD以时间和浓度依赖性方式抑制LoVo、SW480和MC38细胞的增殖，24小时IC₅₀值分别为5.4 μM、5.8 μM和10.7 μM。低浓度PFD即可有效抑制细胞集落形成和迁移，并诱导浓度依赖性凋亡。此外，PFD在非恶性细胞（如PBMCs和HTori-3细胞）中显示出较高的IC₅₀值，表明其具有一定的肿瘤选择性。

PFD下调CRC细胞中PD-L1表达

Western blotting分析表明，PFD以浓度和时间依赖性方式降低PD-L1蛋白水平，但不影响其mRNA表达或稳定性。流式细胞术进一步证实，PFD处理显著降低LoVo和SW480细胞膜表面PD-L1表达。此外，PFD还下调其他免疫检查点分子（CD80、CD86和CD155），提示其具有广谱免疫调节潜能。

PFD通过泛素-蛋白酶体途径诱导PD-L1降解

CHX追踪实验显示，PFD处理加速PD-L1蛋白降解。蛋白酶体抑制剂MG132可逆转PFD引起的PD-L1下调。Co-IP实验证实，PFD促进PD-L1泛素化修饰，表明其通过泛素-蛋白酶体途径介导PD-L1降解。

PFD通过激活AMPK下调PD-L1

机制研究表明，PFD处理增加AMPKα磷酸化（p-AMPKα）水平，激活AMPK信号。使用AMPK抑制剂Compound C可逆转PFD引起的PD-L1下调及增强的T细胞杀伤作用，证实AMPK激活是PFD作用的关键环节。上游激酶LKB1和CAMKK2未参与PFD的AMPK激活。

PFD在体内增强抗肿瘤免疫并与PD-1抗体协同

在MC38荷瘤小鼠模型中，PFD单药或与PD-1抗体联用均显著抑制肿瘤生长，联合治疗表现出最强抑瘤效果。IHC分析显示，PFD处理降低肿瘤组织PD-L1和Ki-67表达。流式细胞术发现，联合治疗显著增加肿瘤内CD8⁺和CD4⁺ T细胞浸润，但对Treg和M1巨噬细胞无显著影响。血清生化和组织学分析表明，PFD治疗未引发明显肝肾功能损伤或器官病理改变，安全性良好。

研究结论与讨论部分强调，PFD作为一种已临床应用的抗精神病药物，通过激活AMPK促进PD-L1泛素化降解，解除对T细胞的抑制，增强抗肿瘤免疫应答。其与PD-1抗体的协同效应为改善MSS型CRC患者ICB疗效提供了新策略。值得注意的是，PFD还下调多个免疫检查点分子，表明其具有多靶点免疫调节功能。然而，PFD的直接分子靶点、在其他癌种中的效果以及长期安全性仍需进一步探索。此外，除蛋白酶体降解途径外，PD-L1的糖基化和细胞内运输等调控机制也可能参与PFD的作用，值得未来深入研究。

总体而言，该研究不仅为CRC免疫治疗提供了新型联合方案，也展示了药物重定位在肿瘤治疗中的巨大潜力。通过将基础机制研究与临床转化相结合，PFD有望成为克服免疫治疗抵抗性的重要工具，推动精准免疫治疗的发展。