hcp和vgrG基因通过磷酸转移酶系统(PTS)调控鲍曼不动杆菌生物膜形成的代谢机制研究

　　本研究针对鲍曼不动杆菌（A. baumannii）感染过程中关键毒力因子T6SS（VI型分泌系统）蛋白Hcp和VgrG对代谢调控及生物膜形成的影响展开。通过构建基因敲除株并利用非靶向代谢组学（LC-MS/MS）技术，发现hcp缺失导致磷酸转移酶系统（PTS）表达下调并显著削弱生物膜形成能力，而双敲除株（ΔhcpΔvgrG）却意外增强生物膜生成，揭示其通过补偿机制调控致病性。该研究为多重耐药菌感染防控提供新靶点。

　　

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是医院内感染的主要机会性病原体之一，尤其对免疫缺陷患者具有高致死风险。其毒力因子包括膜孔蛋白、荚膜多糖、磷脂酶及多种分泌系统，其中VI型分泌系统（Type VI Secretion System, T6SS）能够直接向真核和原核宿主细胞注入毒性效应分子，在细菌-宿主相互作用中起关键作用。T6SS的核心结构蛋白——溶血素共调节蛋白（Hemolysin Coregulated Protein, Hcp）和缬氨酸-甘氨酸重复蛋白G（Valine-Glycine Repeat Protein G, VgrG）被视为该系统活性的分子标记。然而，这些蛋白如何通过代谢调控影响细菌致病性，尤其是生物膜形成能力，尚未明确。

本研究通过同源重组技术构建hcp单敲除株（ATCC17978Δhcp）、vgrG单敲除株（ATCC17978ΔvgrG）及双敲除株（ATCC17978ΔhcpΔvgrG），以野生株（ATCC17978）为对照，与人肺肺泡上皮细胞（HPAEpiC）共培养后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析。技术方法主要包括：基因敲除株构建、细胞-细菌共培养模型、LC-MS/MS代谢物检测、晶体紫生物膜定量、扫描电镜（SEM）形态观察、细菌黏附实验及RT-qPCR基因表达分析。

研究结果

质量控制和多元统计分析

质控样本基峰强度（BPI）色谱图重叠度高，仪器稳定性良好。主成分分析（PCA）显示各组样本明显分离，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型参数（R2Y和Q2Y均>0.5）证实模型可靠性，适用于差异代谢物筛选。

差异代谢物筛选与鉴定

在细菌组分三组对比中，主要差异代谢物为有机酸及其衍生物和有机氧化合物（p<0.05）。共发现5种共有显著差异代谢物：N-乙酰-d-葡萄糖胺-6-磷酸（N-acetyl-d-glucosamine 6-phosphate）、6-羟基假氧化尼古丁（6-hydroxypseudooxynicotine）、3-脱氧-d-甘露辛酮糖酸（3-deoxy-D-manno-octulosonate）、N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid）和N-乙酰胞壁酰丙氨酸（N-acetylmuramoyl-Ala）。

差异代谢物KEGG富集分析

上述代谢物注释出5条共同差异代谢通路（p<0.05）：氨基糖和核苷酸糖代谢、O-抗原核苷酸糖生物合成、磷酸转移酶系统（PTS）、烟酸和烟酰胺代谢、脂多糖生物合成。其中PTS在三种突变株中均呈现显著差异（p=0.01、0.04、0.03）。野生株中PTS整体表达上调，hcp缺失及双敲除导致PTS下调，而vgrG单独缺失未引起显著变化。

生物膜测定

晶体紫染色显示：Δhcp株生物膜形成能力显著降低（p<0.01），ΔvgrG株无显著变化，而双敲除株（ΔhcpΔvgrG）生物膜生成显著增强（p<0.0001）。

扫描电镜（SEM）观察

野生株菌体形态完整、生物膜结构致密；Δhcp株表面损伤、生物膜疏松；ΔvgrG株形态完整；双敲除株不仅结构完整，且胞外聚合物（EPS）分泌增多，生物膜密度显著提升。

细菌黏附实验

所有突变株黏附能力均低于野生株，但双敲除株黏附力仍高于单敲除株。

RT-qPCR基因表达分析

双敲除株中所有生物膜相关基因（bap、csuA、csuB、bfmS、bfmR、pgaA、pgaD）表达均显著上调（p<0.05），与表型结果一致。

结论与讨论

本研究首次揭示hcp与vgrG通过调控PTS代谢通路影响鲍曼不动杆菌生物膜形成。hcp缺失导致PTS下调及生物膜减弱，vgrG单独缺失影响微弱，而双敲除触发补偿机制显著增强生物膜生成。这表明PTS虽与生物膜形成相关，并非唯一调控途径。表型与基因表达一致性证实双敲除株通过上调EPS合成相关基因实现表型逆转。该发现为多重耐药菌的感染机制提供了代谢视角的理论依据，并为针对T6SS及代谢关键点的抗生物膜治疗策略开发奠定基础。论文发表于《Scientific Reports》，为临床应对鲍曼不动杆菌感染提供了新的实验依据和干预思路。