多黏菌素作为外排泵抑制剂逆转肺炎克雷伯菌多重耐药性的新机制研究

《Scientific Reports》：A novel role for colistin as an efflux pump inhibitor in multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae

　　为解决革兰阴性菌多重耐药难题，研究人员探索了多黏菌素（colistin）作为AcrAB-TolC外排泵抑制剂（EPI）的协同抗菌作用。通过基因工程菌株构建、荧光底物积累实验及分子对接等技术，证实亚肾毒性浓度多黏菌素可显著增强氯霉素、米诺环素等抗生素对耐药肺炎克雷伯菌的杀伤效果，并降低耐药突变频率。该研究为临床联合用药提供了新策略。

　　

在全球公共卫生领域，抗菌药物耐药性（AMR）的蔓延正成为日益严峻的挑战。革兰阴性菌凭借其低通透性外膜和活跃的药物外排系统，尤其难以被现有抗生素攻克。其中，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为常见的医院感染病原体，常通过过度表达AcrAB-TolC等多药外排泵，将抗生素主动排出胞外，导致治疗失败。尽管外排泵抑制剂（EPI）被视为逆转耐药性的潜在利器，但现有候选化合物因毒性问题均未进入临床。在这一背景下，南加州大学等机构的研究团队另辟蹊径，探索已上市抗生素多黏菌素（colistin）在低浓度下是否具备外排泵抑制功能，相关成果发表于《Scientific Reports》。

研究团队首先通过基因敲除和过表达技术构建了AcrAB外排泵缺陷及过表达的肺炎克雷伯菌模型，并采用微量肉汤稀释法测定抗生素最小抑菌浓度（MIC）。借助荧光底物（NPN、H33342、EtBr）积累实验、液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析胞内抗生素浓度、扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态、等温滴定量热法（ITC）验证蛋白-药物结合以及分子对接模拟等关键技术，系统评估了多黏菌素对AcrAB外排泵功能的干扰作用。

Impact of acrAB deletion and overexpression on drug phenotypes in the presence and absence of colistin

通过构建acrAB基因敲除（△acrAB）和过表达菌株，发现AcrAB过表达会导致氯霉素、米诺环素、红霉素等抗生素MIC升高2-16倍，而多黏菌素单独使用时MIC保持1 mg/L不变。加入0.5 mg/L多黏菌素后，AcrAB过表达菌株对氯霉素和米诺环素的MIC分别下降2倍和4倍，提示多黏菌素可能通过抑制外排泵增强抗生素效力。

Colistin-mediated Inhibition of N-phenyl-1-napthylamine (NPN) efflux via the AcrAB efflux protein

在NPN外排实验中，葡萄糖激活外排后，加入多黏菌素（5-100 μM）可剂量依赖性地抑制AcrAB过表达菌株的NPN外排，且该效应并非通过EDTA介导的膜破坏或SDS样去垢作用实现。在耐多黏菌素菌株BRKP67中，多黏菌素同样引起NPN荧光强度升高3.7-4.0倍，与阳性对照EPI PaβN效果相当。

Assessing efflux activity using the Hoechst H33342 accumulation assay

Hoechst H33342和EtBr积累实验进一步证实，多黏菌素处理使AcrAB过表达菌株的荧光强度提升2倍以上，而acrAB敲除菌株仅轻微增加，表明多黏菌素特异性抑制AcrAB介导的底物外排。

Enhanced intracellular accumulation of ciprofloxacin induced by colistin

LC/MS分析显示，25-50 μM多黏菌素可使AcrAB过表达菌株胞内环丙沙星浓度提升4.1-5.3倍，显著高于野生型或敲除菌株，从药代动力学角度验证了其外排抑制效果。

Colistin diminishes the frequency of chloramphenicol-resistant mutant selection

在耐药突变频率实验中，多黏菌素（0.125-1 mg/L）与氯霉素联用可将突变频率降低至<10^-3-10^-7，且1 mg/L多黏菌素完全抑制突变菌产生，凸显其延缓耐药性演进的潜力。

Impact of colistin on bacterial cellular morphology

SEM观察发现，≤12.5 μM多黏菌素未引起细菌膜结构明显损伤，25-50 μM时仅出现轻微膜泡化，证明亚毒性浓度下多黏菌素以外排抑制为主而非膜破坏作用。

Exploring the interaction between colistin and AcrB: docking insights

分子对接表明，多黏菌素可与AcrB蛋白的LMU和MIY底物结合域通过疏水相互作用（Phe628、Phe136等）紧密结合，结合能（-10.34至-14.05）优于经典EPI PaβN。ITC实验进一步测得多黏菌素与AcrB的亲和常数K_d=0.32 μM，从结构生物学层面确认其直接靶向作用。

本研究首次揭示多黏菌素在低浓度下可通过直接结合AcrB外排泵蛋白，抑制其底物外排功能，进而恢复氯霉素、米诺环素等抗生素对耐药肺炎克雷伯菌的敏感性。该双重作用机制（高浓度膜破坏/低浓度外排抑制）为优化多黏菌素临床给药方案提供了理论依据。尤其重要的是，亚肾毒性浓度（0.5 mg/L）的多黏菌素即可显著降低耐药突变频率，且其已获批的药代动力学数据有助于快速推进联合疗法临床转化。这一发现不仅为克服革兰阴性菌外排泵介导的耐药性开辟了新路径，也为老药新用策略提供了典范。