深度单细胞质谱流式技术揭示细胞周期经典与非经典状态：为细胞增殖与疾病研究提供新视角

　　本研究针对当前单细胞技术难以精细解析细胞周期（CC）状态、缺乏高通量多路复用能力等问题，开发了一种基于质谱流式（CyTOF）的深度表型分析策略，通过48种CC相关分子标志物，成功捕获了悬浮/贴壁细胞系及原代T细胞中的经典与非经典CC状态，并证实药物扰动可诱导异常CC表型。该研究为理解增殖调控、肿瘤发生及免疫细胞扩增提供了重要技术平台和生物学见解。

　　

细胞周期（Cell Cycle, CC）作为细胞增殖、分化和肿瘤发生等过程的核心生物学事件，其精确调控对维持机体稳态至关重要。然而，传统研究手段如荧光流式细胞术或低维成像技术，往往将细胞周期简化为G0/G1、S、G2/M等粗粒度相位，无法捕捉细胞状态的连续性和异质性。此外，现有方法多依赖于转录组特征或局限于贴壁细胞，缺乏同时实现高通量、多参数检测的能力。这些局限性使得在疾病模型或药物扰动条件下难以系统解析细胞周期的异常状态，例如非经典增殖表型或耐药细胞亚群。

为了突破这些技术瓶颈，斯坦福大学病理学系的Meelad Amouzgar、Patricia Favaro、Sean C. Bendall等研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们开发了一种基于飞行时间质谱流式技术（Cytometry by Time of Flight, CyTOF）的单细胞深度表型分析策略，通过同时检测48种细胞周期相关分子（包括细胞周期蛋白、磷酸化修饰、DNA复制许可因子、染色质状态标志物等），实现了对经典与非经典细胞周期状态的高分辨率捕捉。该研究不仅验证了技术平台在多种细胞系和原代人类T细胞中的适用性，还通过药理扰动实验揭示了CDK抑制剂诱导的细胞周期阻滞及逃逸细胞所呈现的异常状态，为肿瘤治疗和免疫细胞疗法提供了新的洞察。

在研究过程中，团队主要依托以下几项关键技术：单细胞质谱流式技术（CyTOF）用于高通量蛋白表达检测；钯元素条形码标记（palladium barcoding）实现样本多路复用与批次效应控制；IdU（5-Iodo-2′-deoxyuridine）掺入监测DNA复制活性；基于PHATE和MELD算法的降维与扰动评分分析；以及多变量统计模型（如广义线性模型/混合模型）解析细胞状态异质性。所有人类原代T细胞样本均来自斯坦福血液中心健康供体，经CD3/CD28磁珠刺激扩增。

研究结果部分主要包括以下发现：

A single-cell module for deep molecular typing of CC biology

通过设计“最小”、“核心”和“完整”三种分子面板，研究团队系统评估了细胞周期相关分子在不同细胞系中的表达模式，并建立了可用于多系统整合的分析流程。该模块显著提升了细胞状态分辨能力，图形连通性分析表明随着特征数增加，所有细胞系中可捕获的细胞状态多样性均显著上升。

Dimensionality reduction reliably captures cell cycle phase

使用PHATE等非线性降维方法在不同细胞系（NALM6、U937、HEL、293T、JURKAT）及原代T细胞中均成功重构出细胞周期轨迹，并显示出细胞类型特异性的分子表达模式，例如PLK1和pRb(S780)在S/G2/M期高表达，而CDT1仅限于G0/G1期表达。

Variability in CC molecules in phases is cell-type specific

HEL和293T细胞普遍表现出更高的CC分子（如Ki67、CyclinB1、Geminin）表达水平，且与细胞大小相关，但U937虽为较大细胞却未呈现相同趋势，说明细胞来源和内在属性是分子异质性的主要决定因素。

CC quantification reveals distinct patterns across cell lines

多变量聚类（FlowSOM）显示不同细胞系间存在显著CC状态差异，即使未经批次校正，细胞系身份仍可被机器学习模型（多元逻辑回归）以高准确度（＞82%）区分，其中染色质状态和细胞大小相关标志物（如WGA、H3K9ac）贡献最大。

CC analysis decouples canonical and noncanonical states

在所有细胞系中均观察到一定比例的非经典CC细胞（平均23.9%），例如Ki67低但IdU+的S期细胞、G2期仍表达CDT1的细胞。马氏距离分析表明这些细胞在分子表型上显著偏离经典CC状态的细胞群体。

CC perturbation induces noncanonical cell cycle states

使用Palbociclib（CDK4/6抑制剂）、Hydroxyurea（HU，核糖核苷酸还原酶抑制剂）和Nocodazole（微管解聚剂）处理Jurkat细胞可诱导出药物特异性的非经典状态。最近邻（NN）分析显示扰动后细胞与野生型细胞在欧氏距离上显著偏离，且这些异常状态与蛋白质生物合成下降相关。

Multi-systems variance partitioning using mixed modeling

通过混合效应模型对多系统数据（细胞系、药物处理、CC相位、异常性）进行方差分解，发现细胞系身份是CC分子异质性的最主要来源，其次为CC相位，而药物处理与异常性主要通过交互效应发挥作用。

CC inhibitor in ex vivo stimulated primary human T cells

在CD3/CD28刺激的原代T细胞中，多种CDK抑制剂（如Palbociclib、Dinaciclib）可诱导G0/G1期阻滞，且逃逸抑制的细胞表现出更显著的CC状态异常，其分子表型与未处理细胞差异显著。

研究结论与讨论部分强调，该工作所建立的scCC（single-cell Cell Cycle）分析平台不仅克服了现有技术在多参数、高通量、多系统兼容性方面的局限，还首次系统揭示了细胞周期在经典定义之外的广泛异质性。这些非经典状态在基础生理条件及药物扰动下均存在，且与细胞大小、遗传背景、药物耐受等密切相关。此外，该平台可与表观遗传（EpiTOF）、代谢（scMEP）等其它单细胞质谱模块灵活整合，为今后研究细胞周期与其他生物学过程的交叉调控提供了强大工具。尤其在肿瘤免疫治疗领域，该技术有望用于优化T细胞体外扩增工艺、鉴定耐药克隆乃至开发靶向异常增殖状态的精准策略。