4-1BB+Tregs与抑制性祖源耗竭T细胞介导抗PD-L1/抗CTLA-4联合治疗耐药性的单细胞多组学解析

《Cell Reports Medicine》：4-1BB+ Tregs and inhibitory progenitor exhausted T cells confer resistance to anti-PD-L1 and anti-CTLA-4 combination therapy

　　本研究针对免疫检查点抑制剂（ICI）联合疗法在头颈鳞癌（HNSCC）中响应机制不明确的难题，通过单细胞转录组与T细胞受体（TCR）测序技术，揭示了4-1BB+调节性T细胞（Tregs）和新型抑制性祖源耗竭T细胞（Tpex2）是导致抗PD-L1与抗CTLA-4联合治疗耐药的关键细胞亚群。研究发现恶性肿瘤细胞衰老程序与中性粒细胞干扰素信号通路可促进ICI响应，而Tpex1/Tpex2/Tex细胞亚群平衡态可作为跨癌种疗效预测标志。该研究为优化免疫联合治疗方案提供了关键理论依据。

　　

免疫检查点抑制剂革新了头颈鳞癌的治疗格局，然而抗PD-L1单药疗效有限，联合抗CTLA-4疗法在临床实验中却未显现显著优势。这种"1+1≤2"的现象背后，隐藏着怎样的细胞分子机制？耐药性的"罪魁祸首"究竟是谁？为了解开这些谜团，来自Yonsei大学的研究团队开展了一项前瞻性随机Ⅱ期临床试验（NCT03737968），通过单细胞多组学技术深度解析肿瘤微环境动态变化，相关成果发表于《Cell Reports Medicine》。

研究人员收集了29例HNSCC患者接受新辅助Durvalumab（抗PD-L1）单药或联合Tremelimumab（抗CTLA-4）治疗前后的57份肿瘤样本，利用10x Genomics平台生成单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）数据。通过非负矩阵分解（NMF）识别恶性肿瘤细胞功能程序，采用Harmony算法进行批次校正，运用ScATOMIC工具进行细胞类型注释。针对T细胞亚群，结合TCR克隆追踪技术鉴定肿瘤反应性T细胞，通过RNA velocity分析细胞分化轨迹，并利用MultiNicheNet平台解析细胞间相互作用。此外，研究还整合Geneformer基础模型进行基因功能预测，并在多癌种数据集（包括非小细胞肺癌、黑色素瘤等）中进行验证。

恶性肿瘤细胞的衰老程序与早期ICI响应相关

研究团队首先通过NMF算法将恶性肿瘤细胞转录组分解为9个元程序（meta-program）。其中上皮衰老程序（epithelial senescence）与肿瘤消退程度呈正相关，尤其在HPV阳性口咽癌患者中更为显著。该程序包含28个核心基因构成的衰老模块，其表达方差在治疗后显著降低，提示高衰老活性的恶性肿瘤细胞对ICI更敏感。进一步分析发现，将该模块评分纳入随机森林模型，可显著提升对ICI响应的预测准确性，尤其在胶质母细胞瘤等"冷肿瘤"中表现突出。

CXCL13⁺耗竭T细胞及其4-1BB信号与早期ICI响应相关

CD8⁺T细胞亚群分析显示，CXCL13⁺Tex细胞在响应者中显著富集，高表达细胞毒性基因（PRF1、GZMA）和耗竭标志物（PDCD1）。细胞互作分析发现，响应者治疗后TNFSF9-TNFRSF9（4-1BB信号通路）在CXCL13⁺Tex细胞中的活性显著增强。双色免疫组化验证表明，4-1BB信号通路的激活程度与治疗响应正相关。

网络与基础模型揭示CXCL13⁺Tex细胞早期响应关键基因

通过构建响应者与非响应者特异性基因调控网络，发现响应者网络具有更高的节点相似性。筛选出的30个核心枢纽基因（包括ZNF683、PRF1、LAG3等）被定义为"响应者网络特征"。Geneformer模型扰动实验证实，其中19个基因的敲除会导致响应者细胞向非响应者状态转化。

抑制性祖源耗竭T细胞亚群赋予ICI耐药性

通过TCR克隆追踪技术，研究人员鉴定出两个肿瘤反应性祖源耗竭T细胞（Tpex）亚群：ICI响应型Tpex1和ICI耐药型Tpex2。后者特征性表达KLRB1和IL17R，在非响应者中显著富集。轨迹分析显示Tpex1→Tpex2→Tex和Tpex1→Tpex2→HSP⁺是两个主要分化路径。RNA velocity分析证实非响应者中Tpex1向Tpex2的转化概率更高。跨癌种验证表明Tpex2在多种癌症的非响应者中普遍存在。

抗CTLA-4的加入促进4-1BB⁺Tregs从而限制ICI响应

CD4⁺T细胞分析发现，联合治疗组4-1BB⁺Tregs比例显著增加，且呈现最高克隆扩增水平。该亚群高表达CTLA-4，在联合治疗中通过IL-2信号通路激活，其免疫抑制功能未受代谢重编程影响。虽然联合治疗也促进了CXCL13⁺CD4⁺T细胞扩增，但整体CD4⁺T细胞库向免疫抑制状态倾斜，削弱了治疗效果。

中性粒细胞衰老与细胞互作参与ICI响应

研究发现中性粒细胞同样表达衰老模块基因，且联合治疗组衰老评分显著升高。差异表达基因富集于干扰素信号通路，提示中性粒细胞通过干扰素诱导的衰老程序参与ICI响应。细胞互作分析显示，肿瘤相关巨噬细胞、Tstr细胞与4-1BB⁺Tregs的相互作用在非响应者中增强。

本研究通过高分辨率单细胞图谱揭示了ICI联合治疗耐药的双重机制：一方面，抗CTLA-4通过诱导4-1BB⁺Tregs扩增营造免疫抑制微环境；另一方面，Tpex2亚群的分化阻碍了抗肿瘤T细胞的正常演化。这些发现不仅解释了联合疗法临床效果不佳的原因，更提出了Tpex1/（Tpex2+Tex）比值作为新型生物标志物的潜力。该研究为开发针对4-1BB⁺Tregs的靶向策略、优化免疫联合治疗方案提供了关键科学依据，对推动精准免疫治疗发展具有重要意义。