新型含二硫键嘧啶核碱基固相载体连接平台：寡核苷酸缀合的多功能策略

　　本研究针对寡核苷酸配体缀合技术中存在的修饰位点受限与功能单一性问题，开发了一种通过含二硫键连接体将嘧啶核碱基共价固定于固相载体的新方法。该技术突破了传统糖基连接模式，实现了同时包含叠氮基、氨基和二硫键等多重正交功能基团的灵活引入，为DNA/RNA在药物递送、生物检测等领域的应用提供了新型多功能化平台。

　　

随着核酸药物和生物检测技术的快速发展，寡核苷酸与功能配体的缀合技术已成为提升核酸稳定性和靶向性的关键策略。然而传统方法主要依赖核糖/脱氧核糖的羟基进行修饰，存在修饰位点单一、功能基团兼容性有限等问题，严重制约了多功能化寡核苷酸探针的构建效率。为此，研究团队开发了一种基于嘧啶核碱基直接功能化的新型固相载体连接平台。

本研究采用固相合成技术，通过含二硫键的连接体将尿嘧啶和胞嘧啶核碱基直接锚定在固相载体上。关键技术包括：1）设计合成含二硫键的嘧啶核苷衍生物；2）通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）验证修饰寡核苷酸的结构；3）利用巯基-二硫键交换反应实现可逆缀合；4）通过点击化学实现永久性配体标记。

主要研究结果包括：

1. 1.
   连接体设计验证：成功合成含有二硫键（S-S）和伯氨基（-NH₂）的双功能连接体，经质谱证实修饰核苷的分子量符合理论值（误差＜0.02%）。
2. 2.
   固相合成兼容性：该方法与标准亚磷酰胺合成工艺完全兼容，偶联效率达98.5%以上，可制备长达60mer的修饰寡核苷酸。
3. 3.
   正交反应验证：叠氮基团（-N₃）可通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）与炔基配体实现永久性缀合；二硫键可与含巯基配体发生可逆缀合，经还原剂（如DTT）处理后可释放完整寡核苷酸链。
4. 4.
   功能应用演示：成功构建同时携带荧光素和生物素的双标记DNA探针，在微阵列检测中显示优异的信号响应性和特异性。

研究结论表明，该技术突破了传统糖基修饰的局限性，首次实现了通过核碱基直接安装多重正交功能基团。二硫键的可逆缀合特性为靶向递送系统提供了可控释放新途径，而叠氮基团则为生物正交标记提供了永久连接点。这种模块化设计使研究人员能够根据需求灵活组合不同功能基团，大大拓展了寡核苷酸在化学生物学和生物医学领域的应用前景。

讨论部分强调，该方法相较于传统糖基修饰具有三大优势：1）避免影响寡核苷酸二级结构形成；2）可实现定点、定量修饰；3）正交基团组合可定制化。特别是在药物递送领域，可同时实现细胞靶向（通过可逆二硫键连接靶向配体）和实时追踪（通过永久荧光标记），为核酸药物的多功能化设计提供了全新解决方案。该成果发表于《Biochimie》期刊，为核酸修饰技术领域提供了重要的方法论突破。