基于卷曲螺旋蛋白(CC-HEX)的DARPin多价展示平台：一种高效抗SARS-CoV-2的新型治疗策略

　　本研究针对SARS-CoV-2变异快、单克隆抗体生产成本高且周期长的问题，开发了一种基于卷曲螺旋蛋白(CC-HEX)的多价DARPin展示平台。研究人员通过理性设计将12个抗RBD的DARPin与CC-HEX融合，在细菌中高效表达出具有皮摩尔级中和活性的HEX-DARPin融合蛋白。该蛋白对多种病毒变体均表现出强效中和能力，并通过白蛋白结合技术延长了血清半衰期，显著提高了肺部靶向性。这项研究为快速应对病毒变异提供了新型模块化治疗平台，对未来 pandemic 防控具有重要意义。

　　

随着COVID-19全球大流行的持续，病毒快速变异给传统单克隆抗体治疗带来了巨大挑战。单克隆抗体不仅生产成本高昂、周期长，且对新兴变异株的中和效果可能大幅降低。更棘手的是，病毒通过其刺突蛋白(S protein)的受体结合域(RBD)与人体ACE2受体结合入侵细胞的过程需要多价相互作用才能有效阻断，而传统单抗往往力不从心。

为了解决这一难题，佐治亚理工学院的研究团队独辟蹊径，将目光投向了设计锚蛋白重复蛋白(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)这一新兴的抗体模拟物。DARPins具有分子量小、稳定性高、无二硫键、易于细菌表达等突出优点，但单价的DARPin分子中和能力有限。研究人员创新性地利用一种天然自组装 hexameric coiled coil (CC-HEX)作为分子支架，构建了能够同时展示12个抗RBD DARPin的多价融合蛋白——HEX-DARPins。

这项发表在《Biomacromolecules》上的研究采用了多项关键技术：通过蛋白质理性设计构建融合基因；利用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白生产；采用动态光散射(DLS)和圆二色谱(CD)分析蛋白结构和稳定性；使用生物层干涉技术(BLI)测定蛋白与RBD的结合亲和力；通过假病毒中和实验评估对不同变异株(Wuhan、Delta、Omicron)的中和效能；建立ELISA方法检测蛋白与血清白蛋白的结合能力；并在小鼠模型中进行了详细的药代动力学和生物分布研究。

3.1. Design, Expression, and Characterization of DARPin and CC-HEX-Fusion Proteins

研究人员设计了三种不同的HEX-DARPin融合蛋白(HEX-D1、HEX-D2、HEX-D3)，每种都在CC-HEX的两端融合了特定的抗RBD DARPin，形成了包含12个DARPin的多价体系。通过优化的镍柱纯化工艺，获得了高纯度(88-96%)的蛋白产物，产量达到11-22 mg/L。结构表征显示这些蛋白保持了丰富的α-螺旋结构，动态光散射表明其流体力学直径在10.38-18.62 nm范围内，且在4°C下能稳定保存至少2个月。

3.2. HEX-DARPins Strongly Bind to RBD Regions and Potently Inhibit Viral Entry in a Pseudovirus Model

结合实验表明，所有HEX-DARPin蛋白与SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力均达到了亚皮摩尔级别，远超仪器检测下限。假病毒中和实验结果显示，HEX-DARPins对三种不同变异株均表现出卓越的中和能力，IC₅₀值在低皮摩尔范围。与线性DARPin三聚体相比，HEX-DARPins的中和效力提高了4.1-29.6倍，即使按抗RBD单元数量标准化后，其性能仍优于或至少相当于线性对照组。

3.3. HEX-DARPin Configurations Improve Half-Life and Lung Accumulation in a Mouse Model

为解决小分子蛋白快速清除的问题，研究人员设计了能够结合血清白蛋白的变体HEX-D3-ASA和Bilayer HEX-D3-ASA。ELISA实验证实这些蛋白与人和小鼠血清白蛋白均具有纳摩尔级亲和力。有趣的是，在存在人血清白蛋白的情况下，其中和活性不仅没有降低，反而有所增强。小鼠实验显示，白蛋白结合型变体的血清半衰期延长至13-15小时，而非结合型对照组仅约1小时。更令人惊喜的是，HEX-D3-ASA在肺部积累了显著更高的浓度，肺肝信号比达到1.5:1，这一发现对于呼吸道病毒感染治疗具有重要意义。

这项研究成功开发了一种基于CC-HEX的多价DARPin展示平台，解决了小分子中和剂效价不足和药代动力学特性差的双重挑战。HEX-DARPins不仅对多种SARS-CoV-2变异株表现出皮摩尔级的中和活性，更通过白蛋白结合策略实现了血清半衰期的显著延长和肺部靶向性的提升。该平台的模块化设计使其能够快速适应新的病原体或变异株，细菌表达系统则大大降低了生产成本和时间周期。

研究人员在讨论中指出，多价设计不仅提高了结合avidity，还可能通过促进病毒聚集而增强清除效果。他们观察到在DARPin数量与中和效力之间存在"收益递减"现象，提示未来优化时需要平衡valency与空间位阻的关系。

这项研究的成功为应对当前和未来的病毒威胁提供了强有力的技术平台。特别是其出色的肺部靶向性，为通过雾化吸入等局部给药方式实现预防性保护提供了可能。随着进一步的研究和开发，这种基于CC-HEX的模块化设计理念有望成为新一代抗病毒治疗的重要工具，为全球 pandemic preparedness 提供新的解决方案。