工程化诱导型接合质粒：开启可调控水平DNA转移的新型抗菌策略

　　本研究针对抗菌耐药性危机，开发了阿拉伯糖诱导的接合质粒系统，通过删除trbC和trbF等关键基因并实现反式/顺式互补，使接合效率在诱导条件下提升5个数量级，为安全可控的下一代抗菌技术提供了重要生物安全策略。

　　

随着微生物对抗菌药物耐药性的快速发展，公共卫生和全球粮食安全正面临日益严重的威胁。当前基于化学药物的治疗方法通过抑制细菌生长或代谢功能来靶向细胞，但其效果正在逐渐减弱。面对不断升级的抗菌耐药危机，开发创新疗法已成为当务之急。

在这一背景下，细菌接合质粒——一种天然的水平基因转移机制——被重新设计用于向受体细胞递送毒性遗传物质，显示出作为下一代抗菌剂的巨大潜力。然而，非预期基因转移带来的生态风险要求必须建立强大的生物安全控制策略。

近日发表在《Canadian Journal of Microbiology》上的研究，通过开发诱导型接合质粒来解决这些挑战。研究团队利用阿拉伯糖诱导型启动子，评估了13个带有单必需基因缺失的质粒，最终鉴定出trbC和trbF作为严格调控的强候选基因。这些质粒在顺式(cis)和反式(trans)配置中都表现出可诱导性，诱导后的接合效率相比未诱导条件提高了高达5个数量级。

尽管仍然存在接合效率降低和启动子泄漏等挑战，但这项工作为质粒的可控转移奠定了基础，为更安全、更有效的抗菌技术铺平了道路。

关键技术方法

研究采用分子克隆技术构建了13种单基因缺失的接合质粒库，通过酵母介导的克隆方法组装反式互补质粒。利用阿拉伯糖诱导型pBAD启动子调控关键基因表达，通过固体和液体培养基条件下的细菌-细菌接合实验评估效率，并进行了跨界的细菌-酵母接合实验。使用统计学方法（Student's t检验）进行数据分析，确保结果的可靠性。

Materials and methods

菌株与培养条件：使用大肠杆菌Epi300作为受体菌株，在含有新霉素的LB培养基中培养。供体菌株携带顺式或反式质粒，使用庆大霉素和氯霉素进行选择。诱导状态添加阿拉伯糖，抑制状态添加葡萄糖。酵母实验使用酿酒酵母VL6-48，在YPAD培养基中培养。

反式质粒构建：从pTA-Mob 2.0扩增基因插入片段，使用pAGE2.0i模板通过酵母介导克隆组装质粒，通过多重PCR和诊断性酶切验证克隆。

顺式质粒构建：基于pSC5GGv1质粒，删除traJ和trbF基因，将trbF基因置于阿拉伯糖诱导型启动子控制下。

诱导接合实验：在固体和液体培养基中进行细菌-细菌接合实验，评估不同诱导条件下的接合效率。酵母接合实验使用特定培养基条件，观察跨界接合能力。

Results

研究人员使用先前生成的接合质粒pTA-Mob 2.0的单基因缺失库，构建了相应的互补质粒。这些互补质粒包含由pBAD启动子驱动的单个基因，该启动子可通过添加阿拉伯糖诱导转录，通过添加葡萄糖抑制转录。

基于已发表的结果，研究人员选择了13个对从大肠杆菌到酿酒酵母接合至关重要的单基因缺失质粒。实验结果表明，13个缺失质粒中有6个恢复了接合功能，但只有两个基因trbC和trbF在添加葡萄糖时显示出完全的接合抑制。即使在无抑制（未诱导）条件下，这些基因也未观察到接合。

通过四个生物学重复实验进一步评估trbF和trbC缺失/互补质粒组合对大肠杆菌受体的接合情况，结果证实了接合系统的可诱导性。然而，接合效率明显低于亲本质粒pTA-Mob 2.0，降低了近两个数量级。虽然系统表现出一定的泄漏性，但诱导使接合效率显著增强，与未诱导条件相比，产生了约四个数量级更多的转接合子菌落。

基于反式诱导接合质粒的发现，研究人员设计了一种新型质粒pSC6，基于pSC5GGv1。在该构建体中，trbF基因被删除并在诱导型启动子和终止子下重新引入，以最大限度地减少相邻基因或操纵子的意外激活。与反式系统一样，顺式接合系统表现出明确的可诱导性，但接合效率显著降低，与控制质粒pSC5相比降低了约两个数量级。值得注意的是，诱导显著提高了接合效率，相对于未诱导条件实现了三个数量级的增加。

最后进行了液体培养中的接合实验，结果表明pSC6在该环境中是可诱导的，但接合效率显著低于对照质粒。鉴于将该诱导质粒用于抗真菌技术的目标，研究人员进一步测试了其接合到酵母中的能力。pSC6在诱导条件下仅产生八个菌落，无诱导时未观察到菌落。

Discussion

近年来，基于接合的抗菌剂开发引起了广泛关注。随着该技术的发展，其局限性，特别是关于工程质粒释放到环境后的控制问题，需要得到解决。创建诱导型接合系统是水平基因转移技术的基本要求。

本研究旨在开发一种包含接合所需所有组件同时保持严格控制的顺式接合质粒。研究人员检查了13个对pTA-Mob 2.0质粒接合必需的基因，包括那些参与菌毛形成、组装和稳定性的基因（trbC、trbD、trbF、trbI、trbJ、trbL、traF），松弛体复合物组件（traH、traJ、traK、traM），以及松弛体与交配对形成系统的耦合（traG）。与菌毛形成和稳定性相关的基因缺失通常能够进行反式互补，而松弛体复合物中的基因则不能。这种差异可能是由于缺失破坏了相邻基因的调控元件。

研究人员确定了两个候选基因trbC和trbF，当使用pBAD启动子表达时表现出有效的互补。trbC和trbF可能需要显著更高的表达水平才能完全恢复其各自的接合功能。因此，由启动子泄漏引起的低基础表达可能不足以挽救表型，使得这些基因特别适合严格的诱导控制。

研究结果允许研究人员评估顺式和反式系统。在这两种配置中，都实现了可诱导性，尽管接合率有所下降。这种减少可能是由于trbC和trbF周围基因表达改变所致。解决这个问题可能涉及引入部分基因缺失或点突变，并评估候选基因不同表达水平对恢复接合效率的影响。

整合诱导型启动子（如阿拉伯糖诱导型pBAD启动子）增加了必要的生物安全层。这种设计确保接合仅在特定条件下发生，减轻了与意外水平基因转移相关的生态风险。将trbC和trbF鉴定为严格调控的组件为未来诱导型质粒设计提供了良好基础。然而，启动子泄漏和接合效率降低等挑战需要在实际应用中得到解决。

此外，需要测试环境和物种特异性的诱导型启动子。向酵母递送质粒的能力突出了这些系统在抗真菌应用中的潜力。然而，观察到的跨界转移接合效率低的问题需要解决，包括上述方法。此外，可以进行实验室加速进化以提高接合频率。总体而言，这项研究为诱导型接合质粒技术建立了基础框架，同时突出了抗菌和基因工程应用中创新的挑战和机遇。