2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸脱氧类似物作为人神经氨酸酶抑制剂的开发与评价研究

　　为解决糖类类似物极性高、成药性差的难题，研究人员聚焦人神经氨酸酶（hNEU）抑制剂开发，系统合成并评估了DANA骨架的单/双脱氧类似物（如7-、8-、9-脱氧及双脱氧衍生物）。研究发现8-脱氧类似物对NEU2/NEU3抑制活性显著提升，双脱氧类似物对NEU1/NEU2/NEU3具有耐受性，但NEU4活性普遍降低。该研究为设计低极性、高选择性hNEU抑制剂提供了关键结构-活性关系支撑。

　　

在糖生物学和药物化学领域，碳水化合物类似物作为药物开发的潜力日益受到关注。然而，这类分子固有的高极性特性给其成药性带来了严峻挑战。神经氨酸酶（Neuraminidase, NEU）作为一类能够水解唾液酸残基的外切糖苷酶，在人类体内存在四种同工酶（NEU1、NEU2、NEU3、NEU4），它们在细胞内的定位、底物特异性以及生理功能上均存在显著差异。这些酶的异常表达与多种疾病过程密切相关，包括胰岛素信号传导、心血管疾病、炎症反应以及癌症的发生与发展。因此，开发能够选择性抑制特定人神经氨酸酶（hNEU）同工酶的抑制剂，不仅有助于深入探索这些酶的生物学功能，也为相关疾病的治疗提供了新的策略方向。

目前，大多数已知的NEU抑制剂是基于2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸（DANA）骨架开发的。DANA本身是一种广谱的神经氨酸酶抑制剂，能够模拟酶反应过渡态的多个关键特征。尽管DANA对多种NEU具有活性，但不同来源的酶（如病毒、细菌与人类）其活性位点拓扑结构存在显著区别，这使得通过对DANA骨架进行特异性修饰来实现抑制剂的选择性成为可能。一个常见的药物设计策略是系统地移除或替换分子中的羟基，以评估这些极性基团对酶识别和抑制活性的重要性。如果某些羟基被证明是非必需的，或其移除反而能增强抑制活性，那么这些修饰就可能成为开发更高效抑制剂的基础。

在此研究背景下，来自加拿大阿尔伯塔大学的研究团队在《Carbohydrate Research》上发表了一项系统性的研究。他们的工作聚焦于探究DANA骨架上的四个羟基（O4、O7、O8、O9）对于抑制四种人神经氨酸酶同工酶（hNEU）的必要性。研究人员设计并合成了一系列相应的单脱氧（4-、7-、8-、9-位）和双脱氧（7,9-；7,8-；8,9-位）DANA类似物，并详细评估了它们对hNEU的抑制活性。

为开展此项研究，团队运用了多个关键技术方法。合成化学方面，他们以DANA甲基酯为起始原料，通过苯亚甲基缩醛选择性保护策略，结合Barton-McCombie脱氧反应、酯化/水解反应、以及钯催化的脱保护反应，系统性地制备了目标单脱氧和双脱氧衍生物。酶学评价则采用基于荧光底物4-甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸（4MU-NANA）的体外抑制实验，在每种hNEU同工酶的最适pH条件下（NEU1、NEU3、NEU4为pH 4.5；NEU2为pH 5.5）测定各化合物的半抑制浓度（IC₅₀）。人源酶NEU1、NEU2、NEU3和NEU4分别通过HEK293细胞表达、或在大肠杆菌中表达为MBP融合蛋白并纯化后获得。

2.1. 抑制剂合成

研究人员首先合成了4-脱氧-DANA (7)，并以其甲基酯8为共同起始物，通过苯甲醛二甲缩醛选择性形成七元环（9）和五元环（10）苯亚甲基缩醛中间体。从中间体9出发，经选择性苯甲酰化、硼烷-三甲基胺/三氯化铝选择性脱缩醛、Barton-McCombie脱氧（使用1,1'-硫代羰基二咪唑和三(三甲基硅基)硅烷）、以及高铈铵硝酸盐（CAN）脱对甲氧基苄基（PMB）保护基等关键步骤，成功制备了7-脱氧DANA (13)和9-脱氧DANA (17)。从中间体10出发，通过类似的策略，但改用n-三丁基锡氢化物作为还原剂，合成了8-脱氧DANA (22)。双脱氧类似物（24, 29, 31）则从相应的单脱氧中间体出发，通过二次脱氧反应合成。值得注意的是，在合成7,8-双脱氧DANA (29)时，发现使用O-苯基氯硫代甲酸酯比1,1'-硫代羰基二咪唑能更有效地实现C8位的脱氧。

2.2. DANA类似物对hNEU的抑制

活性测试结果显示，hNEU不同同工酶对DANA骨架脱氧修饰的耐受性存在显著差异。4-脱氧DANA (7)对所有测试的hNEU均无显著抑制活性。单脱氧类似物中，7-脱氧(13)和8-脱氧(17)对NEU1的活性相较于DANA (1)分别降低了20倍和8倍，而9-脱氧(22)的活性降低了4倍。相反，NEU2对7-羟基的移除表现出较好的耐受性，而8-脱氧(17)对其抑制活性反而有所提升（IC₅₀ = 10 ± 2 μM），但9-脱氧(22)导致活性下降6倍。NEU3的表现与NEU2类似，8-脱氧(17)是其最有效的单脱氧抑制剂（IC₅₀ = 4 ± 0.9 μM）。对于NEU4，所有测试的单脱氧类似物均导致抑制活性下降3至90倍。

在双脱氧类似物中，NEU1对8,9-双脱氧(31)和7,9-双脱氧(24)表现出与DANA相当的耐受性。NEU2不能耐受7,9-或7,8-双脱氧类似物，但8,9-双脱氧(31)的抑制活性比DANA提高了3倍。NEU3对所有测试的双脱氧类似物均表现出广泛的耐受性。而NEU4再次成为最不耐受的同工酶，所有双脱氧类似物均导致其抑制活性显著降低（14至48倍）。

2.3. NEU3选择性抑制剂的脱氧化

为了探索将脱氧修饰与已知选择性抑制剂结合的策略，研究人员合成了两种已知NEU3抑制剂（化合物5和6）的8-脱氧形式（35和36）。然而，8-脱氧的化合物35水溶性极差，即使在2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）的辅助下也未能显示出抑制活性。8-脱氧的化合物36虽然保持了其对NEU3的选择性，但其抑制效力显著降低（IC₅₀ = 63 ± 6 μM），并且对NEU4的抑制活性相对提升，导致其选择性从母体的超过1000倍大幅降至仅1.5倍。这表明C8-OH的移除与C9位的大体积修饰（如三唑或氨基甲酸酯）之间存在负协同效应，可能与侧链构象灵活性改变或与酶活性位点特定相互作用的丢失有关。

3. 结论与讨论

本研究系统地探讨了DANA骨架脱氧修饰对人神经氨酸酶抑制活性和选择性的影响。研究结果表明，hNEU不同同工酶对脱氧修饰的响应各异，这种差异源于它们活性位点拓扑结构的不同。8-脱氧修饰在针对NEU2和NEU3的抑制剂设计中可能具有积极意义，而NEU4则普遍不容忍任何脱氧修饰。试图将脱氧策略与已知的高选择性抑制剂（通过C9位修饰实现）相结合并未能产生协同效应，反而可能导致活性或选择性的丧失，提示未来的抑制剂优化需要更精细的考虑，包括脱氧可能带来的构象熵罚等因素。该研究不仅提供了宝贵的构效关系（SAR）数据，加深了对hNE酶活性口袋的理解，也为后续设计更低极性、更具类药性的选择性hNEU抑制剂奠定了坚实的化学基础。