即食冷冻核果中第三代头孢菌素和碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的灵敏检测与回收方法开发及评估

　　本研究针对即食冷冻水果中耐药菌污染问题，开发了一种结合Pool-seq高通量筛选与WGS验证的灵敏检测方法，成功从椰子、芒果等样品中分离出携带blaCTX-M、blaNDM等关键耐药基因的ESBL-EB和CP-EB菌株，揭示了食品链在AMR传播中的潜在风险，为食品安全监测提供了重要技术支撑。

　　

在全球公共卫生领域，抗菌药物耐药性（AMR）正逐渐成为严峻的挑战。据世界卫生组织（WHO）指出，AMR每年导致数百万人死亡，并显著增加医疗成本和住院时间。特别值得关注的是，产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶（CP）的肠杆菌目（Enterobacterales，简称EB）细菌——如大肠杆菌（Escherichia coli）和克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）——因其对关键抗生素（如第三代头孢菌素和碳青霉烯类）的耐药性，被列为最高优先级的防控对象。尽管AMR在临床环境中的传播已较为明确，但食物作为耐药菌及耐药基因传播载体的作用仍知之甚少。尤其是即食（Ready-To-Eat, RTE）食品，如冷冻水果，因其无需进一步加工即可食用，如被耐药菌污染，可能直接威胁消费者健康并促进耐药基因在肠道菌群中的传播。

目前，检测食品中的耐药菌面临诸多技术挑战。食品基质复杂，物理、化学和生物组分可能干扰目标菌的分离；且携带关键耐药基因的细菌（如bla_CTX-M、bla_NDM）在样品中比例较低，易被大量背景菌群掩盖。此外，现有监测计划中针对RTE食品中耐药菌的调查十分有限。因此，开发高灵敏度、高效率的检测方法，准确评估食品中AMR菌的流行情况，对制定有效的公共卫生干预策略至关重要。

在这一背景下，由加拿大食品检验局（Canadian Food Inspection Agency）渥太华实验室的Adeeb Nasta、Ashley L. Cooper等研究人员开展了一项研究，致力于开发并评估一种灵敏的方法，用于从即食冷冻核果中检测和回收第三代头孢菌素（3GC）和碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌。该研究近期发表于《Canadian Journal of Microbiology》，为理解食品在AMR传播中的作用提供了新的数据和见解。

为开展本研究，团队选取了161份进口即食冷冻水果样本，包括椰子（n=41）、芒果（n=40）、鳄梨（n=40）和桃子（n=40），这些样本采购自加拿大渥太华和加蒂诺的零售店，来源覆盖11个国家。研究首先通过非选择性富集培养提高细菌载量，随后使用CHROMagar ESBL和添加头孢噻肟（CTX）的MacConkey琼脂（MAC-CTX）进行选择性培养，以分离耐3GC的细菌。从平板上挑选形态各异的菌落进行纯化，共获得611株分离株。为高效筛选目标耐药基因，研究采用 pooled sequencing（Pool-seq）策略，即将同一来源的多个分离株混合提取DNA后进行高通量测序，利用KMA工具比对NCBI AMRFinderPlus数据库识别ESBL和CP基因。对Pool-seq中检出阳性信号的样本，进一步通过PCR和全基因组测序（WGS）确认单株菌的耐药基因携带情况。同时，利用16S rRNA基因扩增子测序分析富集菌群的微生物组成，并通过肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验（AST）。为评估培养方法的敏感性，还采用qPCR直接检测富集样品DNA中的bla_CTX-M和bla_NDM基因。

Aerobic plate counts (APCs) in fruit samples before enrichment and enumeration of nonsusceptible isolates on ESBL-selective media post-enrichment

研究首先分析了冷冻水果样本在富集前的需氧菌落计数（APCs），发现椰子样本的细菌载量最高（平均1.9×10⁵ CFU/g），95%的椰子样本可定量检测到细菌，而鳄梨、芒果和桃子的比例较低。富集后，在CHROMagar ESBL和MAC-CTX平板上，椰子样本中非敏感菌的计数也显著高于其他水果（平均7.8×10⁶ CFU/mL），表明椰子具有更高的微生物负载和耐药菌流行潜力。

ESBL detection in bacterial isolates by Pool-seq

通过Pool-seq对611株分离株进行高通量筛选，研究者在9个椰子池和2个芒果池中检测到ESBL基因家族，包括bla_CTX-M（n=10）、bla_SHV（n=6）和bla_TEM（n=6），还有一个椰子池中检出碳青霉烯酶基因bla_NDM。 taxonomic分析显示，椰子、芒果、鳄梨和桃子样本中分别分离出9、12、9和8个属的细菌，其中Acinetobacter为最优势属，Enterobacter、Pseudomonas和Stenotrophomonas也在所有商品中出现，而Escherichia、Kluyvera和Citrobacter仅见于椰子。

Confirmation of ESBL isolates by whole-genome sequencing and PCR

对Pool-seq筛选出的阳性池中的191株菌进行PCR验证，最终选择32株进行WGS分析。结果显示，这些菌株来源于14份椰子样本和1份芒果样本，包括Enterobacter roggenkampii、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、K. quasipneumoniae和Kluyvera georgiana等物种。 bla_CTX-M-15是最常见的ESBL基因，在26株菌中被检测到，广泛分布于Klebsiella（n=20）、Escherichia（n=5）和Kluyvera（n=1）中。此外，研究还发现一株E. roggenkampii携带bla_NDM-1，位于接合型IncC质粒上；另一株E. coli ST410则同时携带bla_NDM-5和bla_OXA-484，位于IncF型质粒上。多数菌株携带1-15个ARGs，且通过MOB-suite分析预测，这些耐药基因常位于可移动遗传元件上（如IncF、IncY质粒），提示其具有水平转移潜力。

Antimicrobial susceptibility phenotypes

药敏试验表明，所有测序菌株均对氨苄西林耐药，除一株Kluyvera georgiana外，其余均对头孢曲松（3GC）耐药。绝大多数菌株为多重耐药（MDR），对三类以上抗菌药物耐药。作为对照，部分未携带目标ARGs的分离株也表现出一定的耐药表型，但耐药程度较低。

Use of quantitative PCR to rapidly identify blactx-m and blandum in food enrichments

为评估培养方法的敏感性，qPCR检测显示，在161份水果富集样本中，bla_CTX-M和bla_NDM的检出率高于培养法。通过加强菌落筛选，研究者从两份原本培养阴性的样本中成功分离出携带bla_CTX-M-213的Kluyvera菌株和携带bla_NDM-5的E. coli，证实qPCR在检测低丰度目标菌方面更具灵敏度，但也提示在复杂基质中可能存在竞争抑制导致目标菌被掩盖。

Microbial composition of stonefruit enrichment cultures

通过16S rRNA基因扩增子测序分析富集菌群的组成，发现椰子样本的Alpha多样性（Shannon指数）显著高于其他水果，且其菌群组成更为复杂，富含Enterococcus、Staphylococcus、Klebsiella、Acinetobacter和Pseudomonas等属。PERMANOVA分析表明，商品类型和国家来源对菌群结构有显著影响（p≤0.001）。椰子样本中ESKAPEE组细菌（如K. pneumoniae、E. coli）的高相对丰度与ESBL/CP菌的检出相关，提示这些微生物指标可能作为风险评估的标志。

本研究开发了一种结合Pool-seq高通量筛选与WGS验证的灵敏方法，成功从即食冷冻核果中检测和回收了ESBL及CP耐药菌。研究发现，椰子样本中耐药菌的流行率和多样性最高，共从14份椰子和2份芒果样本中分离出32株携带关键耐药基因（如bla_CTX-M-15、bla_NDM-1/bla_NDM-5）的菌株。这些菌株多为多重耐药，且耐药基因常位于可移动遗传元件上，具有跨物种传播的潜力。通过16S测序进一步揭示，高微生物多样性和ESKAPEE细菌的存在与耐药菌检出相关。研究还发现，qPCR直接检测富集DNA的敏感性高于传统培养法，但后者对于获取分离株进行基因组分析至关重要。

该研究的重要意义在于：首先，建立了一种高效、经济的监测策略，可整合至现有食品安全监测体系中，用于追踪食品中的AMR细菌。其次，研究强调了即食食品作为AMR传播媒介的潜在风险，尤其是椰子等加工程度较高的商品，需引起监管部门和公众的重视。此外，基因组数据的积累有助于理解耐药基因的传播动力学，为制定基于One Health理念的干预措施提供科学依据。未来，需扩大样本量和地理代表性，深化对食品在AMR传播中作用的理解，并评估耐药菌的致病性和基因转移风险，以更好地保障公众健康。