ASGPR靶向胶束共载乐伐替尼与COP1 siRNA通过双重靶向策略治疗肝细胞癌的研究

　　本研究针对肝细胞癌治疗中药物的生物利用度低和基因递送效率有限的问题，开发了一种N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）功能化的聚合物胶束共载体系，用于协同递送乐伐替尼（LFT）和靶向E3连接酶COP1（RFWD2）的小干扰RNA（siRNA）。通过体外和体内实验验证，该纳米平台显著增强了肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，在肝癌原位模型中实现73%的肿瘤抑制率，为肝细胞癌的精准治疗提供了新策略。

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤和第三大癌症相关死亡原因，其临床管理面临诸多挑战，包括晚期诊断、治疗方案的区域异质性以及资源有限环境下多学科护理的可及性不足。此外，HCC的分子异质性和肝功能不全严重限制了治疗选择，需要在疗效和肝毒性之间谨慎平衡。尽管近年来在HCC治疗方面取得了进展，如基于机制的小分子和天然产物方法，但乐伐替尼（Lenvatinib, LFT）等药物的口服生物利用度有限，需要较高剂量，导致腹泻和呕吐等不良反应，因此迫切需要结合纳米技术的创新治疗策略，特异性靶向HCC微环境。

自2018年FDA批准首款siRNA药物patisiran以来，RNA干扰（RNAi）已成为一种有前景的恶性肿瘤治疗方法。RNAi是一种转录后基因沉默机制，涉及双链RNA（dsRNA），可有效特异性降解同源mRNA，从而下调靶基因表达。然而，游离siRNA的递送面临诸多挑战，包括其亲水性、负电荷和对RNase降解的敏感性，这些特性阻碍了其稳定循环和细胞膜渗透。因此，研究人员致力于开发能够高效包封抗癌药物和siRNA的共递送载体，确保在肿瘤部位的精确靶向和控制释放。

聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）是一种非病毒载体，以其独特的质子海绵效应和高转染效率而闻名，广泛应用于核酸递送。但PEI基基因递送系统在转染效率和细胞毒性之间存在固有权衡。高分子量PEI（25 kDa）表现出优异的转染效率，但会引起显著的细胞毒性；而低分子量PEI（2 kDa）细胞毒性最小，但转染效率 dramatically 降低。通过交联策略，可以创建具有更高有效分子量的复合物，从而在保持生物相容性的同时增强基因递送能力。

为了增强肿瘤靶向能力，化学修饰策略采用与肿瘤细胞表面优先表达的受体结合的特定配体。去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein Receptor, ASGPR）主要表达于肝细胞膜上，是肝脏特异性药物递送的有吸引力的靶点。N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）是ASGPR的高亲和力配体，可有效促进治疗剂向过表达ASGPR的肝细胞的递送。

然而，ASGPR在HCC中的表达具有显著的异质性，与肿瘤分化状态和疾病进展相关。高分化HCC肿瘤通常保持与正常肝细胞相当的高ASGPR表达水平，而低分化或晚期肿瘤通常表现出显著降低的ASGPR表达。这种受体表达的变异性既是ASGPR靶向治疗的挑战，也是机遇，因为治疗效果可能因个体肿瘤的分子谱而异。

在这项研究中，研究人员开发了一种新型多功能纳米粒子平台，将肿瘤靶向递送、化疗和基因沉默结合在一个统一的策略中。通过全面的理化表征、系统的体外验证和严谨的体内评估，在肝癌原位模型中证明了这种合理设计的共递送系统在克服当前HCC管理局限性方面的转化潜力。该研究发表在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：纳米载体组分的合成与表征，如Pluronic P123-grafted PEI polyplexes（P123-PEI）和GalNAc功能化的Pluronic F127（F127-C₈-GalNAc）的合成；纳米制剂的制备与表征，如薄膜水化法制备混合胶束，并通过动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）等分析其粒径、电位和形态；体外细胞研究，如CCK-8法检测细胞毒性，流式细胞术分析细胞凋亡和周期，共聚焦显微镜观察细胞摄取；分子生物学分析，如qRT-PCR和Western blot检测COP1的表达；以及体内研究，包括原位肿瘤模型的建立、活体成像技术评估生物分布和抗肿瘤功效，组织病理学和免疫组化分析等。所有动物实验均遵循新疆军区总医院实验动物伦理委员会的批准（批准号DWLL2025021205），并使用NCG小鼠（购自广东 Yaokang Biotechnology Co, Ltd）进行。

3.1. 纳米粒子的理化特性及形成机制

研究人员成功合成了P123-PEI共轭物和Pluronic F127-GalNAc，并通过FTIR和NMR等技术进行了结构表征。GalNAc@LFT/siRNA-MMs的平均流体动力学直径为187 nm，PDI为0.41，ζ电位为-0.8 mV，表现出球形形态和良好的稳定性。载药量和包封率测定显示，LFT的包封效率为76%，siRNA的包封效率为76%，药物负载为2.5 wt%。体外释放研究表明，纳米制剂具有缓释特性，96小时内LFT的累积释放率为36%。血清稳定性实验表明，纳米粒子在血清中保持胶体稳定性，48小时内粒径仅增加16%。RNase挑战实验显示，纳米粒子对siRNA提供部分保护，但表面吸附的siRNA在长时间暴露下仍易降解。

3.2. 纳米制剂的药物释放行为及稳定性

与游离LFT相比，所有纳米药物均表现出持续释放，无初始突释现象。在96小时时，LFT/siRNA-MMs、GalNAc@LFT-MMs和GalNAc@LFT/siRNA-MMs的累积释放率分别为64%、50%和36%。这表明靶向配体的存在降低了LFT从纳米药物中的释放速率，增强了纳米胶束的稳定性，有利于其在血液中的运输。

3.3. 通过ASGPR介导的内吞作用增强细胞摄取和靶向效率

通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析，发现GalNAc修饰的纳米胶束在ASGPR阳性的HCC细胞（HepG2和Huh7）中摄取效率显著高于未修饰的纳米胶束，而在ASGPR阴性的HeLa细胞中无显著差异。竞争性抑制实验进一步证实，GalNAc@Cou6/siRNA-MMs的摄取依赖于GalNAc介导的特异性内吞机制。

3.4. 体外抗增殖作用

3.4.1. 在HCC细胞中的选择性抗增殖作用

CCK-8实验表明，GalNAc@LFT/siRNA-MMs对HepG2和Huh7细胞的抑制作用最强，IC₅₀值显著低于游离LFT和其他纳米制剂。例如，在HepG2细胞中，GalNAc@LFT/siRNA-MMs的IC₅₀为3.25 μg/mL，而游离LFT为7.4 μg/mL，提高了56%。

3.4.2. 通过双重靶向增强凋亡诱导

流式细胞术分析显示，GalNAc@LFT/siRNA-MMs处理组在HepG2细胞中的凋亡率为24.4%，而游离LFT组仅为8.2%。联合治疗比单药治疗产生显著更高的凋亡率，表明靶向配体和siRNA的联合使用可增强抗癌活性。

3.4.3. 细胞周期 disruption 和生长抑制

细胞周期分析表明，所有纳米药物和游离LFT均显著减少了DNA复制前阶段（G1期）的细胞比例，S期细胞显著增加。与游离LFT相比，GalNAc@LFT/siRNA-MMs胶束能更有效地将细胞阻滞在S期，阻滞率分别为47.26%（HepG2）、49.69%（Huh7）和35.20%（LM3）。

3.5. 分子机制：COP1沉默增强LFT敏感性

qRT-PCR和Western blot分析显示，LFT/siRNA-MMs和GalNAc@LFT/siRNA-MMs能显著下调三种HCC细胞系中COP1的mRNA和蛋白表达水平。例如，在HepG2细胞中，GalNAc@LFT/siRNA-MMs使COP1 mRNA表达降低至15.00%，蛋白表达也显著抑制。

3.6. 体内肿瘤靶向和生物分布谱

通过小动物活体成像技术观察发现，GalNAc修饰的纳米材料组（GalNAc@Cou6/MMs和GalNAc@Cou6/siRNA-MMs）对HCC具有优异的靶向识别能力，荧光信号主要集中在小鼠肝脏肿瘤区域。而非靶向纳米材料组则表现出较差的靶向识别能力，荧光信号在小鼠体内非特异性分布。成像结果显示，给药后4小时检测到最强的荧光信号，表明GalNAc@LFT/siRNA-MMs在此时间点达到最大积累。

3.7. 共递送方法在原位HCC模型中的卓越抗肿瘤功效

药效学结果表明，治疗14天后，GalNAc@LFT/siRNA-MMs治疗组的肿瘤生物发光信号强度显著低于对照组。具体而言，GalNAc@LFT/siRNA-MMs的肿瘤抑制效果是游离乐伐替尼的3.0倍、常规载药胶束的2.9倍、配体靶向乐伐替尼载药胶束的2.3倍和非靶向siRNA载药胶束的1.5倍。

3.8. 增强肿瘤抑制的组织病理学证据

H&E染色和免疫组化（IHC）分析结果显示，与其他治疗组相比，GalNAc/siRNA共载胶组治疗效果最强，Ki-67阳性增殖区域降至1.3%，CD31阳性血管区域降至0.8%，Caspase-3阳性凋亡区域扩大至25%。这表明该靶向共递送系统可同时影响增殖、血管生成和凋亡，实现全面的肿瘤抑制。

3.9. GalNAc@LFT/siRNA-MMs的安全性谱和生物相容性

在整个治疗期间，各治疗组小鼠体重均未发生显著变化，初步表明纳米材料具有较高的安全性。治疗后，对小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行H&E染色，发现细胞形态正常，未见明显变化，表明无器官损伤。生化参数分析显示，GalNAc@LFT/siRNA-MMs未诱导肝功能指标（ALT、AST）或肾功能指标（CREA、UA）的显著变化，表明其具有良好的体内安全性和低毒性。

本研究成功开发并验证了一种突破性的纳米递送系统（GalNAc@LFT/siRNA-MMs），通过将多种治疗模式创新性地整合到一个合理设计的平台中，在HCC治疗方面取得了显著进展。该系统采用双聚合物策略，利用P123-PEI共轭物进行基因递送，F127-GalNAc进行靶向，是一种新颖的方法，可在不影响任一组件性能的情况下优化两种功能。低分子量PEI与Pluronic共聚物的交联成功解决了转染效率与细胞毒性之间的经典权衡问题，而具有最佳间隔长度的战略性GalNAc修饰确保了与常规靶向策略相比卓越的ASGPR介导的靶向性。

该共递送系统实现了与游离LFT相比显著的肿瘤减少，代表了2.3倍的改善，大大超过了其他共递送系统在HCC中报道的疗效。LFT介导的激酶抑制和COP1沉默增强的肿瘤抑制活性之间的互补治疗机制创建了一种针对多个癌症标志的综合治疗方法。该方法与对肝脏干细胞生物学和血管生成信号网络的新兴理解相一致，将该共递送系统定位为一种复杂的多靶点治疗策略，可解决肿瘤特异性机制和潜在肝脏疾病过程。

通过包括理化表征、细胞摄取研究和体内功效评估的系统评估，我们证明了我们的系统保持了优异的安全性，无器官毒性，进一步支持了临床转化潜力。我们共递送平台的转化必须考虑限制先前HCC治疗成功的现实临床挑战。这些包括由于分子肿瘤异质性导致的患者选择困难、需要多学科护理协调以及不同地区医疗基础设施的差异性。我们的靶向方法在这方面提供了优势，提供了一个统一的治疗平台，可同时针对多个分子通路，可能在保持治疗效果的同时降低治疗方案的复杂性。未来的临床开发应优先在不同患者人群和医疗环境中进行验证，以确保广泛的临床适用性。

ASGPR介导的肝细胞靶向、持续药物释放和联合治疗的结合使该平台成为推进HCC治疗范式的有希望的候选者。其模块化设计允许适应多种治疗载荷和靶向策略，表明在精准纳米医学中具有更广泛的应用潜力。

总之，这种合理设计的多功能共递送系统通过整合靶向递送和联合治疗策略，克服了常规HCC治疗的关键局限性。它为改善这种具有挑战性的恶性肿瘤的结局提供了一种变革性方法，并为肿瘤学中下一代纳米医学平台奠定了基础。未来在免疫活性模型中的验证对于全面评估该方法的治疗潜力至关重要，特别是考虑到免疫系统相互作用在临床HCC治疗结局中的关键作用。