aphA1氨基糖苷类耐药基因的起源揭秘：源自密歇根克雷伯菌的三次独立捕获事件

　　本刊推荐：为追溯广泛存在于革兰阴性菌病原体的aphA1（卡那霉素/新霉素耐药）基因的起源，研究人员通过比较基因组学分析，发现该基因由插入序列（IS）介导，至少三次从Klebsiella michiganensis染色体中独立捕获并 mobilise（移动），形成多种复合/假复合转座子（如TnaphA1-pIE545、PTnaphA1-R478）。该研究揭示了抗生素耐药基因（ARG）的进化新机制，对理解耐药传播及防控具有重要意义。

　　

在人类与细菌感染的漫长斗争中，抗生素的发现与应用曾一度让我们占据上风。然而，细菌也以其惊人的进化能力予以回击，其中最有力的武器之一便是获得抗生素耐药基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）。这些基因如同军火库中的装备，通过水平基因转移在细菌间快速散播，使得曾经有效的药物逐渐失效，构成了全球健康的重大威胁。在众多耐药基因中，aphA1基因显得尤为“功勋卓著”，它编码一种氨基糖苷修饰酶，赋予细菌对卡那霉素（Kanamycin）和新霉素（Neomycin）的强大抵抗力。自上世纪60年代在临床耐药菌株中被发现以来，aphA1基因便广泛存在于多种革兰阴性病原体中，并与多种移动遗传元件相关联，但其最初的源头一直笼罩在迷雾之中，成为一个悬而未解的进化谜题。

破解耐药基因的起源，对于理解其传播动力学和制定有效的防控策略至关重要。以往的研究成功揭示了许多重要耐药基因的“老巢”，例如，超广谱β-内酰胺酶基因bla_SHV源自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的染色体，而bla_CTX-M家族则来自克卢瓦拉菌属（Kluyvera）。这些基因通常被插入序列（Insertion Sequences, IS）捕获，进而形成复合转座子（Compound Transposons）或假复合转座子（Pseudo-compound Transposons, PCTs），从而获得移动能力，在不同菌株和物种间“跳转”。那么，同样重要的aphA1基因，它的故乡又在哪里？它是如何被“招募”到移动元件中，从而开启了其遍布全球的旅程？为了回答这些问题，Robert A. Moran和Ruth M. Hall教授对三个携带aphA1的历史性质粒——pIE545、R478和Rts1——进行了深入的基因组考古学探究。

本研究主要运用了比较基因组学（Comparative Genomics）的分析方法。研究人员对从保存的菌株中复苏的质粒pIE545进行了Illumina测序和序列组装。关键的核心技术在于使用BLAST工具，将转座子中携带的aphA1及其两侧的乘客片段（Passenger Segment）序列与GenBank数据库中的大量细菌染色体序列进行比对，以此寻找高度同源的区域，从而推断其起源。此外，通过分析插入序列的类型及其形成的靶位点重复（Target Site Duplication, TSD），研究者还解析了不同移动元件捕获该基因的分子机制。

aphA1在pIE545质粒的TnaphA1-pIE545转座子中

在来自1990年大肠杆菌JP1290的质粒pIE545中，aphA1基因位于一个5424 bp的复合转座子内，该转座子被命名为TnaphA1-pIE545，其两侧为直接重复的IS102插入序列。其中的aphA1乘客片段长3312 bp。通过比对发现，该片段与多个密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）染色体序列（如中国2020年从玉米黑粉瘤中分离的菌株YZUMF202001）的对应区域具有超过99%的序列一致性。在原始染色体中，该区域包含完整的glnHPQ基因簇（编码谷氨酰胺ABC转运蛋白）和一个C45家族肽酶基因，而在转座子中，glnP基因被IS102的插入所截短。极高的序列相似性表明，TnaphA1-pIE545中的aphA1片段是一次独立的捕获事件，其源头是K. michiganensis的染色体。

aphA1在R478质粒的PTnaphA1-R478假复合转座子中

在1969年从美国分离的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）所含的IncHI2型质粒R478中，aphA1基因位于一个由IS26界定的假复合转座子PTnaphA1-R478中。剔除其中嵌入的另一个含有catA1基因的转座子后，其核心乘客片段长度为4364 bp。该片段与另一组K. michiganensis染色体（如美国临床分离株FDAARGOS_647）的对应区域几乎完全相同（99.98%一致）。值得注意的是，该乘客片段的基因内容与来自pIE545的片段有所不同，其下游缺失了包含肽酶基因和部分glnQ基因的1540 bp区域，并且两侧共享序列区的核苷酸一致性仅约为98%。这清晰地表明，PTnaphA1-R478的乘客片段是从K. michiganensis染色体中一个发生了缺失变异的谱系中，通过IS26介导，被第二次独立捕获的。

aphA1在Rts1质粒的PTn2680转座子中

在较早报道的质粒Rts1中，aphA1位于一个更小的、由IS26界定的单元PTn2680中，其乘客片段仅长2296 bp。该片段与一个中国2019年临床分离的K. michiganensis菌株Kfme267的染色体序列高度同源。然而，在该染色体序列中，aphA1和相邻的rpiR基因均因一个缺失事件而变得不完整。因此，PTn2680的完整乘客片段应源自一个尚未被测序的、与Kfme267亲缘关系密切但拥有完整基因区域的K. michiganensis染色体。其独特的基因环境表明，这是aphA1基因被IS26第三次独立捕获并 mobilization 的事件。

其他短片段可能源自更长的乘客片段

研究还回顾了其他已知的携带aphA1的移动元件，如Tn903、Tn602等。这些元件的乘客片段更短（931-1254 bp），通常只包含aphA1基因本身及极短的侧翼序列。序列比对表明，它们极有可能是从上述发现的更长乘客片段中进一步衍生或截短而来的，而非独立的起源事件。

该研究得出结论：aphA1这一重要的氨基糖苷类耐药基因并非单一起源，而是通过至少三次独立的基因捕获事件，从密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）染色体上不同的遗传背景中被“劫持”出来的。不同的插入序列（IS102、IS26等）分别介导了这些捕获事件，形成了多种多样的复合和假复合转座子结构，从而启动了该基因在全球病原体中的传播之旅。

这一发现具有多重重要意义。首先，它成功追溯了一个极其重要的临床耐药基因的 environmental reservoir（环境库），解决了长达数十年的进化起源问题，为抗生素耐药性的进化生物学提供了关键新知。其次，它揭示了同一种耐药基因可以通过多次独立事件从同一细菌物种的不同遗传背景中被 mobilization，凸显了细菌基因组作为耐药基因宝库的潜力以及移动遗传元件在塑造耐药基因组中的核心作用。最后，该研究强调了对环境菌株和 opportunistic pathogen（机会致病菌）进行持续基因组监测的重要性，因为它们可能是未来新发耐药基因的摇篮。随着测序技术的普及和基因组数据库的不断扩充，未来必将有更多耐药基因的起源被一一揭开，为我们预测和应对耐药性的传播提供关键的科学依据。本研究成果发表于《Journal of Antimicrobial Chemotherapy》。