USP4通过去泛素化A2AR抑制胃癌自噬依赖性铁死亡的作用机制与治疗意义

　　本研究针对胃癌治疗中多药耐药与肿瘤复发的难题，揭示了去泛素化酶USP4通过特异性清除A2AR蛋白Lys48连锁泛素化修饰从而稳定A2AR蛋白，进而抑制自噬依赖性铁死亡的新机制。研究人员通过体内外实验证实靶向USP4-A2AR轴可激活铁死亡程序，显著抑制胃癌进展，为临床开发新型联合治疗策略提供了理论依据。

　　

胃癌作为全球第五大常见癌症和第四大癌症死因，患者确诊时多已处于晚期，生存期通常不足一年。尽管放疗、化疗和靶向治疗是当前主要治疗手段，但多药耐药和肿瘤复发仍是临床面临的重大挑战。铁死亡作为一种新型细胞死亡方式，通过活性氧（ROS）积累和脂质过氧化反应发挥抗肿瘤作用，在多种恶性肿瘤中展现出治疗潜力。然而，自噬依赖性铁死亡在胃癌中的具体调控机制尚未明确。

去泛素化酶USP4在多种癌症中呈现高表达，并通过调节TGF-β、NF-κB等信号通路影响肿瘤进展。既往研究表明USP4在胃癌中高表达且与不良预后相关，但其是否参与铁死亡调控仍属未知。本研究通过系统分析发现USP4在胃癌组织中显著上调，且与患者预后不良密切相关。研究人员通过免疫组化（IHC）和蛋白质印迹（Western blot）验证了USP4在胃癌组织和细胞系中的高表达状态，并选择MGC-803和SNU-5细胞进行敲低实验，在AGS和MKN-1细胞中开展过表达研究。

关键技术方法包括：利用TCGA数据库和人类蛋白质图谱进行生物信息学分析；通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down验证蛋白相互作用；采用体内异种移植模型评估肿瘤生长；使用脂质过氧化测定试剂盒检测MDA、4-HNE和GSH水平；通过mRFP-GFP-LC3腺病毒转染和透射电镜观察自噬流变化；借助特异性抑制剂Vialinin A（USP4抑制剂）和CPI-444（A2AR拮抗剂）进行治疗干预。研究纳入5对胃癌患者配对组织样本进行验证。

Elevated USP4 expression is associated with malignant progression of gastric cancer

研究发现USP4在胃癌组织中表达显著升高，且与患者不良预后相关。免疫组化显示癌组织中USP4阳性细胞比例明显高于癌旁正常组织。在细胞系中，MGC-803和SNU-5呈现高USP4表达，而AGS和MKN-1表达相对较低。通过shRNA成功构建USP4敲低细胞模型，为后续功能研究奠定基础。

USP4 knockdown induces ferroptosis in gastric cancer cells

USP4敲低显著抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，上调上皮标志物E-cadherin，下调间质标志物N-cadherin和Vimentin。更重要的是，USP4敲低诱导铁死亡发生，表现为谷胱甘肽（GSH）耗竭、脂质过氧化产物积累和Fe²⁺浓度升高。Western blot显示铁死亡促进蛋白ACSL4上调，抑制蛋白FTH1和GPX4下调，ROS水平显著增加。联合铁死亡诱导剂Erastin可协同抑制细胞存活。

USP4-mediated autophagy regulation in ferroptosis process of gastric cancer cells

研究发现USP4敲低导致线粒体数量减少，自噬流增强，自噬体数量增加，ATG5蛋白水平上升而P62水平下降。相反，USP4过表达抑制自噬过程。使用氯喹（CQ）或ATG5敲低抑制自噬后，USP4敲低诱导的铁死亡表型被显著逆转，证实USP4通过调节自噬影响铁死亡进程。

USP4 regulates A2AR via Lys48-linked deubiquitination in gastric cancer cells

通过生物信息学分析发现A2AR可能与USP4存在相互作用。实验证实USP4与A2AR直接结合，且USP4敲低降低A2AR蛋白水平。机制研究表明USP4通过其去泛素化酶活性特异性清除A2AR的Lys48连锁泛素化链，而非Lys63连锁链。关键位点突变实验证实C311位点是USP4介导A2AR去泛素化的必需位点。

USP4 promotes gastric cancer growth by inhibiting ferroptosis through A2AR activation

A2AR敲低显著抑制胃癌细胞侵袭能力，并逆转USP4过表达促癌效应。体内实验显示USP4过表达促进肿瘤生长，而A2AR敲低抑制肿瘤生长，组织学检查显示A2AR敲低导致肿瘤结构松散，Ki67染色表明USP4通过A2AR促进肿瘤细胞增殖。

Targeting the USP4-A2AR axis for ferroptosis inhibition in gastric cancer treatment

联合使用Vialinin A和CPI-444可协同诱导铁死亡，抑制胃癌细胞增殖和侵袭，在体内显著抑制肿瘤生长并破坏肿瘤组织结构。Ki67免疫组化显示联合治疗组细胞增殖抑制最显著，证实靶向USP4-A2AR轴的治疗潜力。

研究结论表明USP4通过去泛素化作用稳定A2AR蛋白，抑制自噬依赖性铁死亡，从而促进胃癌进展。靶向USP4-A2AR轴可激活铁死亡程序，抑制肿瘤生长。讨论部分强调该研究首次揭示USP4在调节自噬-铁死亡轴中的关键作用，阐明了USP4通过特异性去泛素化机制稳定A2AR的分子机理，为临床开发针对USP4-A2AR轴的联合治疗策略提供了理论基础。研究还发现USP4表达与免疫抑制性细胞浸润和基质/免疫评分正相关，与MAPK、NF-κB和JAK-STAT等促肿瘤通路激活相关，提示USP4可能同时通过免疫调节和信号通路调控等多重机制影响胃癌进展。